2022 ELN 建议：多参数流式细胞术在骨髓异常增生评估中的应用 — 分析问题

一、核心分析问题：样本处理与前体准备缺陷（最基础、最易忽视）

1. 样本采集与运输问题

• 骨髓稀释：抽吸时负压过大、多次穿刺，导致外周血污染（有核细胞中淋巴细胞比例异常升高），骨髓原始细胞、髓系前体细胞比例被稀释，无法反映真实骨髓增生状态；
• 运输延迟 / 条件不当：样本采集后未在4~8℃、24h 内送至实验室，或室温久置、反复冻融，导致细胞凋亡、抗原降解（如 CD34、HLA-DR、髓系分化抗原丢失）；
• 抗凝剂使用错误：使用肝素抗凝（而非 EDTA），导致细胞聚集、抗体结合受阻，流式检测出现大量碎片峰，无法准确圈定目标细胞群。

2. 样本前处理操作不规范

• 红细胞裂解不充分 / 过度：裂解时间过短导致红细胞残留，干扰有核细胞圈门；裂解时间过长、裂解液浓度过高，导致幼稚细胞（如 CD34 + 细胞）破裂，丢失目标分析群；
• 细胞计数与上样误差：未进行精准细胞计数，上样量过多 / 过少，导致低比例异常细胞群（如 0.5% 以下的异常髓系前体细胞）被漏检；
• 抗体孵育条件失控：孵育温度（应室温 / 2~8℃）、时间（15~30min）不符，或抗体浓度过低，导致抗原 - 抗体结合不充分，出现弱阳性或阴性误判。

3. 共识推荐解决方案

• 骨髓采集：采用胸骨 / 髂后上棘穿刺，抽吸量≤2ml，避免外周血污染；立即加入 EDTA 抗凝管，标注采集时间；
• 运输标准：4~8℃冷链运输，24h 内完成检测，无法及时检测时加入细胞保护剂；
• 前处理质控：严格按照 SOP 进行红细胞裂解（推荐商用温和裂解液），裂解后镜检确认无红细胞残留；上样前进行细胞计数，保证有效检测细胞数≥1×10^6；抗体孵育全程避光，严格遵循试剂说明书的温度与时间要求。

二、核心分析问题：抗体组合与设门策略不合理（诊断核心短板）

1. 抗体组合设计缺陷

• 缺乏 MDS 靶向抗体 panel：仅使用基础髓系抗体（CD13、CD33、CD45），未纳入MDS 诊断核心抗体，无法识别髓系前体细胞的分化异常；
   
  ✅ ELN 明确 MDS 评估必选核心抗体组合（髓系前体细胞面板）：CD45/SSC（设门基础）、CD34、CD117、HLA-DR、CD13、CD33、CD14、CD15、CD64、CD71、CD41（排除巨核细胞污染）；
• 抗体标记通道冲突：荧光素选择不当（如强荧光与弱荧光搭配不合理），导致低表达抗原（如 CD34 在异常髓系前体细胞上的低表达）被高背景荧光掩盖；
• 未纳入对照抗体：缺乏同型对照、阳性对照，无法区分特异性染色与非特异性结合，导致弱阳性结果的误判（如将非特异性结合判定为抗原低表达）。

2. 设门策略混乱（最常见的分析错误）

• 未遵循 “层级设门法”：直接圈定全骨髓有核细胞，未先通过 CD45/SSC 圈定髓系前体细胞群（MPC）（CD45dim/SSClow），导致异常 MPC 被成熟血细胞群干扰；
• 漏圈关键细胞群：忽略红系前体细胞（EPC）（CD45dim/SSClow、CD71+、血型糖蛋白 A+）、巨核系前体细胞的分析，而 MDS 中红系、巨核系分化异常是重要诊断依据；
• 设门阈值主观化：无统一的设门阈值标准，不同技师对 “弱阳性”“低表达” 的判定差异大，导致同一样本不同实验室检测结果不一致。

3. MDS 特异性设门与抗体组合核心要求（ELN 2022 强推荐）

1. 层级设门流程：CD45/SSC→圈定有核细胞→排除红细胞 / 碎片→圈定 MPC（CD45dim/SSClow）→分群分析 CD34+MPC、CD34-MPC 的抗原表达；同时单独圈定 EPC、巨核系前体细胞进行亚群分析；
2. 核心抗体 panel 分两类：
   • 髓系前体细胞分化评估：CD34、CD117、HLA-DR、CD13、CD33、CD15、CD64（识别粒系分化阻滞）；
   • 红系 / 巨核系评估：CD71、血型糖蛋白 A、CD41、CD61（识别红系成熟障碍、巨核系小巨核细胞）；
    
3. 设门阈值标准化：以同型对照为基准，抗原表达平均荧光强度（MFI）降低≥50% 判定为低表达，完全不表达为缺失，异常高表达为过表达；

三、核心分析问题：抗原表达模式解读偏差（诊断误判主因）

1. 过度解读：生理性 / 反应性改变误判为 MDS 异常

• 生理性变异：儿童 / 老年骨髓的髓系前体细胞抗原表达轻度异于成人（如儿童 CD34 + 细胞 HLA-DR 表达略低），被误判为分化异常；
• 反应性骨髓增生：感染、炎症、缺铁性贫血等导致的髓系前体细胞一过性抗原表达改变（如感染时 CD15 在粒系前体细胞上高表达），被错误判定为 MDS 的成熟阻滞；
• 骨髓移植后状态：异基因造血干细胞移植后髓系重建过程中，抗原表达呈一过性异常，被误判为 MDS 复发。

2. 解读不足：漏识 MDS 特异性异常模式

• 忽略 “微小异常”：仅关注明显的抗原缺失 / 低表达，漏检轻度的分化异常（如 CD34+MPC 中 CD13/CD33 表达比例不对称、HLA-DR 异质性表达），而此类微小异常是早期 MDS 的重要 FCM 特征；
• 单一异常模式解读：未结合多参数联合异常，MDS 的 FCM 诊断需满足 **≥2 个独立的髓系前体细胞群异常 **（如 CD34+MPC HLA-DR 低表达 + 粒系前体细胞 CD15 成熟阻滞），单一异常不足以诊断；
• 忽略红系 / 巨核系异常：仅分析粒系前体细胞，漏检红系前体细胞的 CD71 / 血型糖蛋白 A 表达异常（如红系成熟阻滞）、巨核系前体细胞的小巨核细胞特征（CD41 + 细胞体积偏小、CD61 低表达），而红系 / 巨核系异常是低危 MDS 的核心 FCM 表现。

3. MDS 特异性 FCM 异常模式（ELN 2022 明确定义，避免漏 / 误判）

4. 共识推荐解读原则

1. 整合诊断：FCM 结果必须与骨髓形态学（金标准）、细胞遗传学、分子学结果结合，单独 FCM 异常不能诊断 MDS；
2. 排除反应性因素：解读前需排除感染、炎症、营养缺乏、药物等反应性骨髓改变，此类情况的 FCM 异常多为一过性，去除诱因后可恢复；
3. 多参数联合判定：诊断 MDS 需满足 **≥2 个独立的髓系前体细胞群异常 **，且异常模式持续存在（复查后无改善）；
4. 结合临床特征：结合患者年龄、血常规（持续性血细胞减少）、病程（慢性病程，≥6 个月），排除急性白血病、骨髓增殖性肿瘤、再生障碍性贫血等疾病。

四、核心分析问题：质量控制（QC）体系缺失（实验室层面短板）

1. 室内质控缺失

• 无日常质控品：未使用商品化的骨髓 FCM 质控品（如 CD34 + 细胞质控品、髓系分化抗原质控品），无法监测仪器的灵敏度、抗体结合效率的日常波动；
• 仪器校准不规范：未定期对流式细胞仪进行光路、荧光强度、电压的校准，导致不同时间点的检测结果 MFI 无法对比；
• 技师操作缺乏标准化：不同技师的前处理、设门、解读存在主观差异，无统一的 SOP 与操作培训。

2. 室间质评参与不足

• 未加入骨髓异常增生 FCM 的室间质评计划（如 ELN、EQA 国际室间质评），无法发现本实验室的系统性分析误差（如设门策略偏差、抗体组合缺陷）；
• 室间质评结果反馈后，未进行根因分析与流程改进，导致相同错误反复出现。

3. 结果报告与溯源性差

• 报告内容不完整：仅报告阳性 / 阴性，未提供具体的异常细胞比例、抗原表达 MFI、异常模式描述，无法为临床提供精准的诊断依据；
• 无结果溯源：未留存检测原始数据（如 FCS 文件）、设门图、抗体使用记录，无法对异常结果进行复核与溯源。

4. ELN 2022 QC 体系建设核心要求

1. 室内质控：每日检测商品化骨髓 FCM 质控品，监测 CD34 + 细胞比例、抗原表达 MFI 的变异系数（CV）≤15%；每月对流式细胞仪进行全面校准，做好校准记录；
2. 标准化 SOP：制定涵盖样本采集、运输、前处理、抗体孵育、设门、解读、报告的全流程 SOP，所有技师经培训考核合格后方可操作；
3. 室间质评：强制参与 ELN 或国家层面的 MDS FCM 室间质评，每年至少 2 次，对不合格结果进行根因分析并整改；
4. 报告标准化：报告需包含检测方法、抗体组合、设门策略、异常细胞群比例、具体异常模式、与形态学 / 细胞遗传学的整合分析、诊断建议，并留存 FCS 原始数据至少 5 年。

五、特殊分析问题：低危 MDS / 骨髓增生异常 - 骨髓增殖性肿瘤（MDS-MPN）的 FCM 评估

1. 低危 MDS 的分析难点与解决

• 难点：髓系前体细胞异常轻微，仅表现为单一抗原的轻度低表达或红系 / 巨核系的微小异常，易被漏检；
• 解决：① 增加检测细胞数（有效检测数≥2×10^6），提高低比例异常细胞群的检出率；② 重点分析红系 / 巨核系前体细胞，低危 MDS 的异常多集中于此；③ 结合分子学结果（如 TET2、ASXL1 等基因突变），整合诊断。

2. MDS-MPN 的分析难点与解决

• 难点：同时存在骨髓增生异常（髓系分化异常）与骨髓增殖（细胞过度增殖），FCM 模式为异常分化 + 细胞比例升高，易与纯 MPN 混淆；
• 解决：① 同时评估髓系前体细胞的分化模式与细胞增殖程度（如 CD34 + 细胞比例、粒系前体细胞增殖指数）；② 结合细胞遗传学（如 Ph-、JAK2/CALR/MPL 突变阴性）与形态学（如病态造血 + 增殖特征），排除纯 MPN。

六、ELN 2022 核心建议：规避分析问题的整体策略

1. 标准化全流程：从样本采集、运输、前处理到抗体组合、设门、解读，制定统一的 SOP，严格遵循 ELN 推荐的技术标准；
2. 强化质量控制：建立完善的室内质控体系，强制参与室间质评，保证检测结果的准确性与可比性；
3. 整合多学科诊断：FCM 结果需由血液病理医师 + 临床血液科医师共同解读，结合形态学、细胞遗传学、分子学、临床特征进行整合诊断，避免单独依赖 FCM；
4. 实验室能力建设：对技师与医师进行 MDS FCM 专项培训，掌握 MDS 特异性异常模式与鉴别诊断要点；
5. 避免过度使用：FCM 作为辅助诊断工具，用于形态学诊断不确定的病例（如疑似 MDS 但形态学病态造血不典型），而非所有血细胞减少患者的常规检测，避免资源浪费与过度诊断。