定向纳米孔病原学测序技术在器官移植感染防治中应用的多中心专家共识
一、引言
器官移植是治疗终末期器官疾病的重要手段，但术后感染是影响患者预后的关键因素。传统的感染检测和诊断方法，如病原分离培养、免疫学检测和分子生物学检测等，在灵敏度、特异性和检测速度方面存在局限性，难以满足临床精准防治感染的需求。定向纳米孔病原学测序技术（以下简称 “纳米孔测序技术”）作为第三代测序技术，以其独特的读长优势、实时检测和灵活适应性等特点，在病原体鉴定、结构变异分析和耐药基因解析中展现出显著优势，为器官移植术后感染的防治提供了新的技术手段。为规范纳米孔测序技术在器官移植术后感染防治中的应用，提高诊断效率和精准性，改善患者预后，特制定本多中心专家共识。
二、纳米孔测序技术的原理与特点
（一）原理
纳米孔测序技术的基本原理是将 DNA 分子单链化，在驱动酶的协助下，使单链 DNA 分子逐个通过纳米孔。当碱基通过纳米孔时，会阻断孔内的离子流，产生不同的电信号，这些电信号被实时记录下来，通过特定算法将其翻译成相应的碱基序列，从而实现从样本处理到数据生成的实时分析，且该技术无需对样本进行扩增。
（二）特点
读长优势：纳米孔测序技术能够读取超长的 DNA 或 RNA 分子序列，单次运行中读取的序列长度可达数万甚至数十万碱基。这有助于复杂基因组区域的分析以及病原体全基因组测序，在鉴定病原体亚型、追踪感染源和研究病原体进化方面具有重要意义，可有效减少因短读长拼接导致的误差和信息丢失。
结构变异检测优势：其超长读长在识别复杂区域，如重复序列、串联重复、大片段插入或缺失以及染色体重排等方面具有突出优势。在临床应用中，对于下呼吸道感染患者的病原体基因组分析，长读长不仅能精准识别耐药基因的插入或移动元件的存在，还能解析病原体基因组的重组或进化过程。同时，长读长对检测与病原体毒力或抗性相关的大型结构变异（如毒力岛或抗性岛）具有天然优势，为复杂感染的诊断和个体化治疗提供重要依据，还可避免因短读长无法覆盖重复区域或跨变异区域而导致的假阴性问题，显著提高检测的灵敏度和特异性。
快速、灵活适应临床需求：纳米孔测序技术凭借实时数据生成和无需扩增的特点，可直接读取单分子核酸链，实现从样本处理到数据生成的实时分析。数小时内即可完成病原体检测并得到初步结果，有效缩短了从采样到报告的时间窗口，满足临床急性需求。并且可根据临床需求调整测序深度和终点，实现快速诊断与精细分析的平衡，极大地支持个体化精准医疗。此外，该技术适用于多种样本类型，如血液、痰液、组织等，操作灵活，尤其在器官移植术后抢救性治疗或复杂、多重感染的检测中优势显著，可快速识别病原体，及时指导抗感染治疗。
三、纳米孔测序技术的临床应用建议
（一）术前评估
供者器官检测：供者体内的多种病原体，如巨细胞病毒、Epstein - Barr 病毒、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等病毒，狂犬病病毒、破伤风梭菌、结核分枝杆菌等特异性感染病原体，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌、耐万古霉素肠球菌等耐药菌，以及念珠菌、曲霉菌、隐球菌、毛霉菌等真菌感染病原体，都有可能通过供者器官传播给受者，引发严重的术后感染并发症。因此，建议在器官获取后，尽快采集供者器官组织、血液、尿液等样本，采用纳米孔测序技术进行全面的病原体检测，以评估供者器官的感染风险。对于检测出病原体的供者器官，需结合病原体种类、感染程度以及受者的具体情况，谨慎评估是否进行移植，并制定相应的预防和治疗方案。
受者感染风险评估：对受者术前进行全面的感染筛查，采集血液、痰液、尿液等样本，利用纳米孔测序技术检测潜在的病原体感染。同时，结合受者的基础疾病、免疫状态、既往感染史等因素，综合评估其术后感染的风险。对于高风险受者，如合并糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、长期使用免疫抑制剂等，应加强术前的感染防控措施，如进行预防性抗感染治疗、调整免疫抑制剂方案等。
（二）术后感染诊断
疑似感染患者的检测：当器官移植受者出现发热、寒战、咳嗽、咳痰、腹痛、腹泻、伤口红肿等疑似感染症状时，应及时采集相应的临床样本，如血液、痰液、尿液、伤口分泌物、穿刺液等，优先采用纳米孔测序技术进行病原体检测。与传统检测方法相比，纳米孔测序技术能够快速、全面地检测出多种病原体，包括细菌、病毒、真菌、寄生虫等，尤其对于罕见病原体和混合感染的诊断具有明显优势。
感染病原体的精准鉴定：对于通过纳米孔测序技术检测到的病原体，进一步分析其基因序列，确定病原体的具体种类、亚型以及耐药基因等信息。例如，对于细菌感染，明确其耐药基因的携带情况，有助于指导临床合理选用抗菌药物；对于病毒感染，确定病毒的亚型和变异情况，对于评估病情和制定治疗方案具有重要意义。
与传统检测方法的联合应用：纳米孔测序技术虽然具有诸多优势，但也不能完全替代传统的感染检测方法。在临床实践中，建议将纳米孔测序技术与传统检测方法，如病原培养、血清学检测、PCR 等相结合，相互补充，提高诊断的准确性。例如，对于纳米孔测序技术检测到的病原体，可通过病原培养进行进一步的药敏试验，以确定最佳的治疗方案；对于传统检测方法高度怀疑但未明确的病原体，可借助纳米孔测序技术进行全面排查。
（三）抗感染治疗监测
治疗效果评估：在抗感染治疗过程中，定期采集患者的临床样本，采用纳米孔测序技术监测病原体的载量变化，评估治疗效果。如果病原体载量持续下降，说明治疗有效；如果病原体载量无明显变化或上升，可能需要调整治疗方案，如更换抗菌药物、加大药物剂量或联合使用其他治疗方法。
耐药监测：密切关注病原体耐药基因的变化情况，及时发现耐药菌株的出现。对于出现耐药的病原体，根据耐药基因的特点和药物敏感性试验结果，合理调整抗感染治疗方案，避免盲目用药，提高治疗成功率。
感染复发监测：器官移植受者在抗感染治疗后，仍有感染复发的风险。通过纳米孔测序技术对患者进行定期随访检测，可及时发现潜在的感染复发迹象，提前采取预防和治疗措施，降低感染复发对患者健康的影响。
四、纳米孔测序技术的检测流程
（一）样本采集
样本类型选择：根据患者的临床表现和疑似感染部位，选择合适的样本类型。常见的样本类型包括血液、痰液、尿液、粪便、伤口分泌物、穿刺液、组织活检标本等。对于全身性感染，血液样本是首选；对于呼吸道感染，痰液或支气管肺泡灌洗液样本较为合适；对于泌尿系统感染，尿液样本是主要检测对象；对于深部组织感染，组织活检标本可提供更准确的病原体信息。
样本采集方法：严格按照无菌操作原则进行样本采集，避免样本污染。采集血液样本时，应使用专用的采血器材，采集足够的血量；采集痰液样本时，应指导患者进行深部咳痰，尽量采集清晨第一口痰；采集尿液样本时，应采用清洁中段尿；采集组织活检标本时，应在影像学引导下进行精准穿刺，确保获取足够的组织量。
样本保存与运输：采集后的样本应尽快送往实验室进行检测。如果不能及时检测，应根据样本类型选择合适的保存方法和保存条件。一般来说，血液样本可在常温下保存数小时，尿液样本可在 4℃冰箱中保存 1 - 2 天，痰液样本可在 - 20℃冰箱中保存较长时间。样本运输过程中，应注意保持样本的完整性和稳定性，避免剧烈震动和温度波动，同时要确保样本的生物安全，防止病原体泄漏造成污染。
（二）样本处理
核酸提取：采用合适的核酸提取方法，从样本中提取高质量的核酸。对于不同类型的样本，需要选择相应的核酸提取试剂盒和提取方法。例如，对于血液样本，可采用磁珠法或柱提法进行核酸提取；对于痰液样本，由于其含有较多的杂质和黏液，需要先进行预处理，再进行核酸提取。提取过程中，要严格按照操作规程进行，确保核酸的纯度和完整性。
文库构建：将提取的核酸进行文库构建，使其能够适应纳米孔测序平台的要求。文库构建方法有多种，可根据实际情况选择合适的方法。常见的文库构建方法包括连接测序接头、片段化、末端修复等步骤。在文库构建过程中，要注意控制反应条件，确保文库的质量和多样性。
质量控制：对提取的核酸和构建的文库进行质量控制，检测其浓度、纯度、完整性等指标。常用的质量控制方法包括核酸定量检测（如紫外分光光度法、荧光定量法等）、凝胶电泳分析（检测核酸的完整性和片段大小）、文库质检（如使用生物分析仪检测文库的质量和插入片段大小）等。只有质量合格的核酸和文库才能进行后续的测序分析。
（三）测序分析
测序平台选择：目前市场上有多种纳米孔测序平台可供选择，不同的测序平台在测序通量、读长、准确性、成本等方面存在差异。在选择测序平台时，应根据实验室的实际需求、样本量、检测项目以及预算等因素进行综合考虑，选择最适合的测序平台。
测序参数设置：根据样本类型、检测目的和测序平台的特点，合理设置测序参数，如测序深度、测序时间、测序模式等。测序深度是影响检测灵敏度和准确性的重要因素，对于常见病原体的检测，一般建议测序深度达到一定水平；对于罕见病原体或低丰度病原体的检测，可能需要更高的测序深度。测序时间和测序模式也会影响测序结果，应根据实际情况进行优化。
数据处理与分析：测序完成后，对获得的原始数据进行处理和分析。首先，对原始数据进行质量控制，去除低质量的序列和接头序列；然后，利用生物信息学分析软件对数据进行比对、注释和分析，确定样本中存在的病原体种类、基因序列以及耐药基因等信息。在数据分析过程中，要建立完善的生物信息学分析流程和数据库，确保分析结果的准确性和可靠性。
（四）结果报告与解读
结果报告内容：测序分析结果应及时、准确地报告给临床医生。结果报告应包括样本信息、检测方法、检测结果、病原体的种类和亚型、耐药基因信息、检测结果的临床意义以及建议等内容。报告格式应规范、简洁，便于临床医生阅读和理解。
结果解读：临床医生在解读纳米孔测序技术的检测结果时，应结合患者的临床表现、病史、其他实验室检查结果以及影像学检查结果等进行综合分析。对于检测到的病原体，要判断其是否为真正的致病菌，还是定植菌或污染菌。同时，要根据病原体的耐药基因信息，合理选择抗感染药物，制定个体化的治疗方案。如果对检测结果存在疑问，应及时与实验室沟通，共同探讨解决方案。
五、注意事项
生物安全：纳米孔测序技术涉及病原体的检测，在样本采集、处理、测序和分析过程中，要严格遵守生物安全操作规程，防止病原体泄漏和实验室感染。实验室应具备相应的生物安全防护设施和设备，操作人员应接受生物安全培训，正确佩戴个人防护用品。
技术人员培训：纳米孔测序技术是一项较为复杂的技术，需要专业的技术人员进行操作和分析。实验室应定期对技术人员进行培训，提高其技术水平和业务能力，确保检测结果的准确性和可靠性。技术人员应熟悉纳米孔测序技术的原理、操作流程、数据处理和分析方法，以及相关的生物信息学知识。
质量控制与质量保证：建立完善的质量控制和质量保证体系，定期对纳米孔测序技术的检测流程进行质量评估和监控。包括对样本采集、核酸提取、文库构建、测序分析等各个环节进行质量控制，定期进行室内质量控制和室间质量评价，确保检测结果的准确性和一致性。同时，要对检测设备进行定期维护和校准，保证设备的正常运行。
成本效益分析：纳米孔测序技术的检测成本相对较高，在临床应用中，应进行成本效益分析，合理选择检测项目和检测时机。对于一些疑似感染但病情较轻的患者，可先采用传统检测方法进行初步筛查；对于病情严重、高度怀疑感染且传统检测方法无法明确诊断的患者，可考虑采用纳米孔测序技术进行检测，以提高诊断效率和治疗效果。
六、结语
纳米孔测序技术作为一种新型的病原学检测技术，在器官移植感染防治中具有广阔的应用前景。本共识围绕纳米孔测序技术在器官移植术后感染防治中的规范化应用，从技术原理、临床应用建议及检测流程等方面进行了阐述，旨在推动该技术在器官移植术后感染诊断和治疗中的合理应用，提高诊断效率与精准性，改善患者预后。随着技术的不断发展和完善，纳米孔测序技术有望在器官移植感染防治领域发挥更大的作用。同时，也需要进一步开展多中心、大样本的临床研究，积累更多的临床经验，不断优化检测流程和临床应用策略，为器官移植患者提供更加优质的医疗服务。