一、引言
血液循环肿瘤 DNA（ctDNA）检测作为一种新兴的液体活检技术，在肿瘤的早期诊断、治疗监测及预后评估等方面展现出巨大潜力。韩国临床分子生物学会（KSLM）制定本指南，旨在为 ctDNA 检测在韩国临床实践中的规范化应用提供指导。
二、ctDNA 检测的原理与技术
（一）原理
肿瘤细胞在生长、凋亡或坏死过程中会释放 DNA 片段到血液循环中，这些携带肿瘤特异性基因突变的 DNA 即为 ctDNA。通过对 ctDNA 的检测，可获取肿瘤相关的遗传信息。其检测原理基于对 ctDNA 中特定基因突变、甲基化状态、拷贝数变异等特征的分析。
（二）检测技术
数字 PCR（dPCR）：将含有 ctDNA 的样本进行大量稀释并分配到多个微小反应单元中，使每个反应单元中至多含有一个 ctDNA 分子。通过对每个反应单元进行 PCR 扩增，根据阳性反应单元的比例来定量 ctDNA 的浓度。该技术灵敏度高，可检测低丰度的 ctDNA 突变，但通量较低，一次只能检测有限的几个靶点。
二代测序（NGS）：包括全基因组测序（WGS）、全外显子测序（WES）和靶向测序。WGS 可对整个基因组进行测序，能发现所有类型的遗传变异，但成本高、数据分析复杂。WES 主要针对外显子区域测序，可检测大部分与疾病相关的变异，成本相对较低。靶向测序则针对预先选定的特定基因区域进行测序，可提高检测灵敏度和特异性，同时降低成本，适用于已知特定基因突变的检测。NGS 技术通量高，可同时检测多个基因的多种变异类型，但对检测环境和数据分析要求较高。
基于质谱的检测技术：如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI - TOF MS），通过检测 DNA 片段的质量 - 电荷比来识别特定的基因突变。该技术具有高分辨率、高准确性的特点，可同时检测多个突变位点，但样本制备过程较为复杂。
三、ctDNA 检测的临床应用
（一）肿瘤早期诊断
肺癌：对于高危人群（如长期吸烟、有肺癌家族史），检测 ctDNA 中的特定基因突变（如 EGFR、KRAS 等），有助于早期发现肺癌。研究表明，在肺癌患者出现影像学可见的肿瘤之前，ctDNA 中可能已出现相关基因突变，为早期干预提供机会。
结直肠癌：通过检测 ctDNA 中的 APC、KRAS、BRAF 等基因突变，结合粪便潜血试验等传统筛查方法，可提高结直肠癌的早期诊断率。尤其对于无症状的高危人群，ctDNA 检测可作为一种无创的筛查手段。
乳腺癌：检测 ctDNA 中的 BRCA1/2 基因突变，不仅可用于遗传性乳腺癌的风险评估，还可能在早期乳腺癌患者中发现隐匿的肿瘤细胞释放的 ctDNA，辅助早期诊断。
（二）治疗监测
疗效评估：在肿瘤治疗过程中，动态监测 ctDNA 水平。若治疗有效，ctDNA 水平通常会下降；若治疗无效或出现耐药，ctDNA 水平可能升高或保持不变。例如，在肺癌靶向治疗中，通过定期检测 ctDNA 中 EGFR 基因突变状态及突变丰度，可及时评估靶向药物的疗效。
复发监测：肿瘤患者治疗后，定期检测 ctDNA 可早期发现肿瘤复发。ctDNA 的出现往往早于影像学发现的复发迹象，为及时采取挽救性治疗措施提供时间窗口。如结直肠癌患者术后，通过监测 ctDNA，可在复发症状出现前数月甚至数年发现肿瘤复发的迹象。
（三）预后评估
ctDNA 的突变类型、丰度及清除情况与肿瘤患者的预后密切相关。例如，在黑色素瘤患者中，治疗后 ctDNA 持续阳性或突变丰度较高的患者，其无进展生存期和总生存期往往较短。通过检测 ctDNA，可对患者的预后进行分层，为制定个性化的治疗方案提供依据。
四、检测流程规范
（一）样本采集
采血时间：根据检测目的确定采血时间。对于治疗监测，一般在治疗前、治疗过程中的特定时间点（如每周期治疗结束后）及治疗后定期采血。对于早期诊断，可在体检时或怀疑肿瘤时采血。
采血管选择：使用专门用于 ctDNA 检测的采血管，如含游离 DNA 稳定剂的采血管，可有效防止血细胞破裂释放基因组 DNA 对 ctDNA 检测的干扰，同时保持 ctDNA 的稳定性。
采血量：通常采血量为 5 - 10ml，具体根据检测方法和检测平台的要求而定。
（二）样本处理
离心分离：采血后应尽快进行离心处理，一般先以相对较低的转速（如 1600 - 2000g）离心 10 - 15 分钟，分离血浆，去除细胞成分。然后将上层血浆转移至新的离心管，再以较高转速（如 10000 - 16000g）离心 10 分钟，进一步去除残留的细胞碎片。
样本保存：分离后的血浆若不能及时检测，应保存于 - 20℃或 - 80℃。避免反复冻融，以免影响 ctDNA 的完整性和检测结果。
（三）检测与数据分析
检测方法选择：根据临床需求、样本类型及实验室条件选择合适的检测方法。对于已知特定基因突变的检测，dPCR 或靶向 NGS 可能是较好的选择；对于全面了解肿瘤遗传变异情况，WES 或 WGS 可能更合适。
数据分析：使用专业的生物信息学软件对检测数据进行分析。对于 NGS 数据，需进行序列比对、变异检测、注释等一系列分析步骤，以准确识别 ctDNA 中的基因突变。同时，要结合数据库（如 ClinVar、COSMIC 等）对变异进行解读，判断其临床意义。
五、检测结果解读与报告
（一）结果解读
突变解读：对于检测到的 ctDNA 突变，首先判断其是否为已知的肿瘤相关突变。若为已知突变，结合数据库和文献资料，评估其与肿瘤发生、发展、治疗及预后的关系。对于新发现的突变，需进一步研究其功能和临床意义。
丰度分析：ctDNA 突变丰度反映了肿瘤细胞释放到血液中的 DNA 量，与肿瘤负荷、疾病进展等相关。一般来说，突变丰度越高，肿瘤负荷可能越大。但不同肿瘤类型和检测方法的突变丰度阈值可能不同，需结合具体情况分析。
动态变化分析：对于治疗监测和复发监测，关注 ctDNA 水平的动态变化比单次检测结果更有意义。连续监测 ctDNA 水平的上升或下降趋势，可及时调整治疗方案或发现肿瘤复发。
（二）报告内容
患者基本信息：包括姓名、性别、年龄、住院号、临床诊断等。
样本信息：样本类型、采集时间、采集部位等。
检测方法：详细说明所采用的检测技术，如 dPCR、NGS（具体为 WGS、WES 还是靶向测序）等。
检测结果：列出检测到的 ctDNA 突变类型、突变位点、突变丰度等信息。对于阴性结果，明确报告未检测到已知的肿瘤相关突变。
结果解释：对检测结果进行简要解释，说明其临床意义，如是否支持肿瘤诊断、对治疗的指导意义、与预后的关系等。同时，提供相关的参考建议，如进一步的检测或治疗措施。
六、质量控制
（一）室内质量控制
仪器设备校准：定期对检测仪器（如 PCR 仪、测序仪等）进行校准，确保仪器性能稳定。按照仪器使用说明书的要求，对仪器的温度、光学系统等关键参数进行校准和验证。
试剂质量控制：使用经过验证的高质量试剂，对每批次试剂进行质量检测，包括灵敏度、特异性、稳定性等指标。建立试剂的质量控制记录，确保试剂质量可靠。
样本质量监控：对样本采集、处理过程进行质量监控，定期检查采血管的质量、离心条件等是否符合要求。通过检测已知浓度的标准样本，评估样本处理过程对 ctDNA 检测的影响。
数据分析质量控制：建立标准化的数据分析流程，对生物信息学分析过程进行质量控制。定期对分析结果进行人工审核，确保数据分析的准确性。同时，对分析软件和数据库进行定期更新，以保证变异解读的准确性。
（二）室间质量评价
积极参加国内外权威机构组织的室间质量评价活动，如欧洲分子基因诊断质量联盟（EMQN）或美国病理学家协会（CAP）组织的 ctDNA 检测室间质评。通过与其他实验室进行比对，评估本实验室的检测能力和水平。对室间质评结果进行深入分析，针对存在的问题及时采取改进措施，提高检测质量。
七、局限性与挑战
（一）技术局限性
检测灵敏度和特异性：尽管现有检测技术不断发展，但仍存在一定的假阳性和假阴性率。例如，dPCR 可能因引物设计、样本中杂质等因素导致假阳性；NGS 可能因测序深度不足或数据分析算法问题导致假阴性。
肿瘤异质性：肿瘤细胞具有高度异质性，不同部位的肿瘤细胞可能存在不同的基因突变。ctDNA 仅反映了释放到血液循环中的肿瘤细胞的遗传信息，可能无法完全代表肿瘤整体的基因突变情况。
（二）临床应用挑战
缺乏统一标准：目前 ctDNA 检测在样本采集、处理、检测方法选择、结果解读等方面缺乏统一的标准和规范，导致不同实验室之间的检测结果可比性较差。
成本效益问题：一些先进的检测技术（如 WGS、WES）成本较高，限制了其在临床中的广泛应用。同时，ctDNA 检测结果对临床治疗决策的影响及成本效益关系尚需进一步研究。
八、未来展望
技术创新：不断研发新的检测技术和方法，提高检测的灵敏度、特异性和准确性。例如，开发基于新原理的检测技术，或对现有技术进行优化，以更好地克服肿瘤异质性和提高检测效率。
标准化建设：推动 ctDNA 检测的标准化进程，建立统一的样本采集、处理、检测和结果解读标准，提高不同实验室之间检测结果的可比性。这将有助于 ctDNA 检测在临床中的广泛应用和推广。
多组学联合应用：结合其他组学技术（如蛋白质组学、代谢组学等），全面了解肿瘤的生物学特性。通过多组学联合分析，可更准确地评估肿瘤的发生、发展、治疗反应和预后，为肿瘤的精准治疗提供更全面的依据。