RACE技术的简介 cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。 完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。 末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克...
免疫学染色 1.为了洗去顶层琼脂上的残余物和细胞碎片，将硝酸纤维素滤膜一次最多5张转移放在摇床上的盘子（1010cm）内，用25ml TBS室温洗涤10 min 2次。 2.然后滤膜用25ml封闭缓冲液（每张90mm直径的滤膜至少15ml）于室温温育 30min，以封闭滤膜上的非特异性...
（三）免疫筛选 制备Sepharose偶联细菌裂解液 1.各用一个E.coli温度敏感溶源菌株（BTA 282（gt11amp3）或BNN 97）单菌落接种于27.5ml培养基并于32℃生长过夜。 2.过夜培养物用LB培养基稀释100倍，于32℃生长至OD600值为0.5。 3.于45℃温育15min诱导噬菌体表达...
（一）gt11 cDNA文库铺平板 宿主细菌制备 1.用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种25ml LB培养基（Y1088用于噬菌斑杂交，Y1090用于免疫筛选），于37℃振荡培养过夜。 2.将过夜培养物以3000g离心5min。 3.分别用2ml -dil（10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol /L M...
[大量制备生产单链噬菌体DNA] 1.新鲜过夜培养的宿主菌XLI-Blue，以1：20稀释在LB培养液中，在37℃培养扩增2小时。 2.加1ml含单链cDNA的上清液。 3.再于37℃继续培养2小时。 4.然后将全部溶液转到500~1000mlLB中，生长5~6小时。 5.9500rpm离心60分钟，除去细菌...
[cDNA末端磷酸化] 1.70℃灭活反应后，稍微离心一下，置室温5分钟。 2.在反应混合物（10l）中加入： 1l10连接缓冲液 2l10mMATP 1l（10）DNA激酶 [限制性内切酶消化]以得到粘性末端 1.限制性内切酶消化DNA和载体。 2.在37℃保温1~5小时，然后冷却到室温，如果选...
[第一条链cDNA合成] 1.合成第一条cDNA链时，所有试剂应按下列顺序依次加入： 10第一条链合成缓冲液5.0l 10mMdNTPMix(1.4g/l)2.5l(终浓度1.25mM) Linkerprimer(1.4l，终浓度100g/l) DEPcH2O RNaseblockⅡ(1U/l)1.0 mRNA1~5g 混合，离心20秒钟，室温放置10分钟...
接头-衔接子与cDNA的连接 8.将下列试剂加入到已削成平末端的DNA中： 10T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 2l 800~1000 ng 的磷酸化接头或衔接子 2l T4噬菌体DNA连接酶（105 Weiss单位/ml） 1l 10 mmol/L ATP 2l 混匀后，在16℃温育8~12h。 9.从反应液中吸出0.5l贮...
10. Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的dNTP和 cDNA分开。 11. 加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的cDNA，将样品置于冰上至少15分钟，然后在微量离心机上以最...
分为六个阶段： 阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2：cDNA第二链的合成 阶段3：cDNA的甲基化 阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 阶段6：cDNA与噬菌体臂的连接 [阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链] 1.在置于冰上的无...