一、实验目的 掌握植物cDNA合成的原理和方法 二、实验原理 反转录酶主要用于体外cDNA的合成。目前最常用的反转录酶(reverse transcriptase) 有SuperscriptII、M-MLV和AMV等。它们具有依赖于RNA或DNA的DNA聚合酶活性和RNaseH酶活性，可以以RNA分子为模板，合成...

[实验原理] 总RNA，经寡聚(d丁)纤维素亲和层析柱分离出mRNA，以寡聚(d丁)为引物，经反转录合成双链cDNA。先用反转录酶合成第一条cDNA链；经碱降解作用除去RNA模板后用大肠杆菌DNA聚合酶，以第一条链cDNA的3末端结构为引物合成第二链，最后形成双链cDNA。 [仪...

2. 电泳分析 (1) 用50mM NaCl， 1mM EDTA制备1.4%的碱性琼脂糖电泳， 并置碱性电泳缓冲液中30分钟。 (2) 取样品液， 用TE调整体积， 使第一链和第二链产率测定液的体积相同，加入等体积的2样品缓冲液(20mmol/L NaOH， 20%甘油，0.025%溴粉兰）。 (3) 加样，电...

3. 第一链产量测定 第一链掺入率(%)= 掺入cpm/总cpm 100% 掺入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/l 反应体积(l)(第一链掺入率) 设330为每mol dNTP的平均分子量 合成cDNA量(ng)=掺入dNTP (nmol)330ng/nmol mRNA向cDNA转变率=合成cDNA量(ng) / 模板RNA量(ng)100% 例如总放...

Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶，使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶，cDNA第二链合成采用置换合成法，采用 RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成，最后用T4 DNA聚合...

关于设计siRNA以及siRNA设计对siRNA功能的影响，至今还没有可靠的规律。虽然我们可以通过对mRNA实验分析准确的找到一段基因的全部siRNA最佳作用位置，但这个过程十分耗时且昂贵，不推荐常规实验使用。一种做法是每个目标序列设计3-4对siRNAs，实验选择较有效...

体外制备 1.化学合成 许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3―4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列...

1998年，Andrew Fire和Craig Mello提出了一项新技术：通过dsRNA诱导特异基因的沉默，即所谓RNAi。2000年，Amy Pasquinelli等将lin-4和let-7作小时序RNAs(stRNAs，mall temporal RNAs)。 RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链...

尽管现在人们可以越来越准确地预测microRNA的沉默效果，但还是需要高通量而且准确的直接验证技术来验证microRNA的沉默效果。 microRNA 这个在生物科学史上具有重要意义的小分子，在2008年又一次成为了世人瞩目的焦点。microRNA通过与目标mRNA的3UTR区域结合来...

1． 希望软件可以在 web 上使用。 即用户可以访问我们的网站， 输入基因代码， 即可自行在网上设计 siRNA Oligo 。 2． 可参照的软件形式： 见如下网站： www.dharmacon.com www.ambion.com www.qiagen.com 3． 希望能就每一个所指定的基因找到至少四对以上可...