2．pBlueScriptII的双酶切消化 1．以如下体系进行EcoRI酶切： pBSK(+) X l（6g） ddH2O 174-X l 10Buffer E 20 l 混匀，加入限制性内切酶： EcoRI （10U/ l） 6 l 总体积为200 l。 2．轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。 3．37℃，水浴1hr。 4...

4EcoRIadaptor加接: 1.往双链 cDNA沉淀中加入9ulEcoRI adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀; 2.溶解完成后,顺序加入下列试剂: 1.2ul 10Ligase Buffer 1ul 10mMrATP 1ul T4DNA Ligase(4U/ul) 3.混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接; 5双链...

三．cDNA双链合成 1.SupersciptII RT合成第一链: 1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入 xul mRNA(大约500ng) 1ul XhoIPrimer(1.4ug/ul) (5GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3) 11-xulRNase-freewater （大于500ngmRNA分n管(500ng/tube)合成...

二.mRNA的分离 1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 准备工作： 1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解 Oligotex.,然后置于室温。 2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。 3.将 OEB Buffer 置于70℃水浴中，待...

(二)动物组织totalRNA的提取 1．根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。 2．将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。 3．根据表1加入适量2M的...

一.Total RNA的提取 (一) 试剂配制 准备工作： 1.研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml /100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。 2.50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1DEPC水浸泡过夜后，121...

（一） cDNA序列的测定 一．原理 DNA 序列测定技术，目前主要是根据Sanger 等提出的酶法和Maxam和Gilber 提出的化学降解法，这两种方法的原理大致相同。这里主要介绍Sanger 的酶法双脱氧链终止法。 双脱氧链终止法是Sanger 等人于1977 年建立起来的。它是利用...

一 原理 逆转录PCR (RT-PCR) 具有灵敏度高、专一性好、简便快捷等优点，其不仅是定量检测微量样品和表达水平低的基因的一种有效方法，同时也是从真核生物中获得目的基因的一条重要途径。 cDNA的合成是RT-PCR的重要环节。以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，随...

最常用的基因分离方法需要建立组织或细胞RNA的cDNA库，然后用抗体或 DNA探针筛选出感兴趣的基因。虽然这个方法已成功地克隆了大量基因，但建立和筛 选CDNA库是一项非常耗时．费力的工作，而且用寡聚核苷酸作探针进行筛选需大量蛋 白质序列结构的资料。聚合酶...

具体的实验步骤 cDNA第一条链的合成： 我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的 cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。 注意： 在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。 将管放于冰上，以终止...