蛋白质分析技术(ELISA、Western Blot、免疫荧光与免疫组化技术)-

2 类型
（1）间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体，检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。
常用于临床血清中自身抗体的检测，以及杂交瘤上清特异性抗体的筛选。如血清中PDCD5自身抗体的检测。

(2) 双抗体夹心法测抗原
是检测抗原最常用的方法。
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。
常用的组合：单克隆抗体＋多克隆抗体
单克隆抗体＋单克隆抗体
后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。
用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。

双抗体夹心法测抗原的方法：
捕获抗体包被→封闭（3％BSA）→待测抗原→洗涤（含0.1％Tween的PBS)→酶标单抗或多抗→洗涤→显色→检测
(3)竞争法测抗原
1）抗体固相测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。
其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。
方法：抗体包被→封闭→同时加入待测抗原和酶标抗原→洗涤→酶底物→显色→ELISA reader检测
2）抗原固相测抗原
其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。
方法:
a: 抗原包被96孔板； b:封闭;
c: 待测抗原与抗体反应一定时间； d: 加入96孔板
e: 洗涤 f：加入酶标二抗
g：洗涤 h：显色和检测

（4）IgM抗体的检测
1）间接法：
间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定血清中的IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。因此，如果用抗IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。
方法：
a: 抗原包被96孔酶标板； b:封闭;
c: 待测血清与A蛋白反应一定时间后离心
d: 吸取上清液加入96孔酶标板
e: 洗涤 f：加入酶标抗IgM的抗体
g：洗涤 h：显色和检测
2）捕获包被法（夹心法）
先用抗人IgM抗体包被ELISA板，以捕获血清标本中的IgM（包括针对抗原特异性的IgM和非特异性的IgM)。然后加入相应抗原，继而加入针对抗原特异的酶标抗体，再与底物作用，颜色的深浅即与标本中的IgM含量成正相关。
方法：
a: 抗人IgM抗体包被96孔酶标板； b:封闭;
c: 加入待测血清； d: 洗涤96孔酶标板
e: 加入相应抗原 f：加入抗原特异的酶标抗体
g：洗涤 h：显色和检测
（5） ABS-ELISA技术 （Avidin Biotin system-ELISA
原理
亲和素是一种分子量是60，000的碱性蛋白，由四个相同亚基组成，每个亚基有一个生物素分子结合点。两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种材料所标记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入底物后，产生颜色反应。这一系统可以大大提高 ELISA的灵敏度。
操作过程：
抗原包被→封闭→待检标本→生物素化抗体→洗涤→ 酶标记亲和素→洗涤→加底物显色和检测

三 免疫荧光技术
利用某些荧光素，如FITC、R-PE等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。（一）细胞膜蛋白分子的检测
原理：
细胞膜表面的抗原或受体可特异地与相应的抗体或配体结合，将针对细胞表面抗原的抗体或配体用不同的荧光素标记，根据不同荧光物质的最大激发和发射波长的不同，即可准确定量每种荧光物质的强度，从而推出相应细胞表面抗原表达量

1 直接法：细胞＋荧光素标记的抗CD分子的抗体→4ºC反应30-60min→荧光显微镜观察或流式细胞计分析。
2 间接法：细胞＋抗CD分子的抗体→4ºC 反应30-60min 荧光素标记的二抗 4ºC 反应30-60min→荧光显微镜观察或流式细胞计分析

悬浮细胞：用PBS洗二次后再做染色
贴壁细胞：先用胰酶消化成悬浮细胞再染色

2 Annexin V检测技术 (检测细胞凋亡的一个常规指标)
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为 35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

样本处理和染色方法

1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应 5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

（二）细胞内蛋白分子的检测
细胞内细胞因子的检测、凋亡相关蛋白TFAR19的检测等。
操作过程：
（1）直接法：
细胞→3％多聚甲醛固定和 渗透化→封闭→荧光素标记的抗体→ 洗涤→荧光显微镜观察或流式细胞计分析