三．凝胶孔径的调节
凝胶孔径、机械性能(弹性)、透明度等在很大程度上取决于Acr和Bis二者的总浓度T%。T%越大，孔径越小，机械强度则增加。凝胶的特性是分子筛效应。在聚合前调节单体的浓度来控制凝胶孔径大小，有利于针对样品分子大小，增加分辨力。为此可以根据分离样品分子大小配制不同孔径的凝胶。一般大孔胶易碎，小孔胶难以取出。另外考虑选择适宜的缓冲液。缓冲液的作用一是用来维持容器内和凝胶外的pH恒定，二是作为在电场中传导电流的电解质。要使缓冲液很好地完成这些作用，必须注意三个条件：第一，缓冲液不与被分离的物质相互作用；第二，缓冲液pH值不能使蛋白质变性，对于分离蛋白质的最大pH限度通常是 pH4.5～9.0；最后还要考虑到缓冲液的离子强度。
四．分离蛋白的基本原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类，前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因此具有很高的分辩率。
不连续体系由电极缓冲液、样品胶、浓缩胶及分离胶所组成，它们在直立的玻璃管（或2层玻璃板中）排列顺序依次为上层样品胶、中间浓缩胶、下层分离胶。样品胶是核黄素催化聚合而成的大孔胶，其作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲液稀释。目前，一般不用样品胶，直接在样品液中加入等体积40% 的蔗糖，同样具有防止对流及样品被稀释的作用。实际上，浓缩胶胶的延续，凝胶浓度及值与样品胶完全相同，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的扁盘，从而提高分离效果。分离胶是由过硫酸铵催化聚合而成的小孔胶，主要起分子筛作用。在此电泳体系中，有2种孔径的凝胶、2种缓冲液体系、3种pH值，因而形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。PAGE具有较高的分辨率，就是因为在电泳体系中集样品浓缩效应、分子筛效应及电荷效应为一体。下面就这3种物理效应的原理，分别加以说明。
1．样品的浓缩效应
不连续电泳一般含有3种性质不完全一样的凝胶，其组成如下：
（1）凝胶孔径不连续性 在上述3层凝胶中，样品胶及浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶。在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，蛋白质颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。
（2）缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 该系统的电极缓冲液是pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，样品胶和浓缩胶是用pH6.7的Tris-HCl缓冲液制成的，电泳时，HCl在任何pH溶液中均易解离出Mg2+,它在电场中迁移率快，走在最前面称为前导离子或快离子。在电极缓冲液中，除有Tris外，还有甘氨酸，它在 pH8.3的电极缓冲液中，易解离出NH2CH2COO-，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中解离度最小，在电场中的迁移率很慢，称为尾随离子或慢离子。血清中，大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH6.7或8.3时均带负电荷，在电场中，都向正极移动，其有效迁移率介于快离子和慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩为极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此，Mg2+及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后再分成多个区带。电泳开始时，在电流的作用下，浓缩胶中的氯离子（快离子）有效泳动率超过蛋白质的有效泳动率，很快泳动到最前面，蛋白质紧随于其后，而G1y-成为慢离子，在最后面。快离子向前移动，而在快离子原来停留的那部分区域则形成了低离子浓度区，即低导区，电势梯度增大。因此，低导电压区就有较高的电势梯度，这种高电势又迫使蛋白质离子与慢离子在此区域加速前进，追赶快离子。夹在快、慢离子间的蛋白质样品就在这个追赶过程中被逐渐地压缩聚集成一条狭窄的起始区带。
2．分子筛效应：
分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，此即分子筛效应。颗位小，形状为园球形的样品分子，通过凝胶孔洞时受到的阻力小，移动较快；反之，颗粒大，形状不规则的样品分子，通过凝胶的阻力较大，移动慢。
3．电荷效应
当样品进入分离胶后，由于每种蛋白质所带的电荷多少不同，因而迁移率也不同。电荷多的，分子小的泳动速度快，反之，则慢。于是，各种蛋白质在凝胶中得以分离，并以一定的顺序排列成一个一个圆盘状。
等电聚焦电泳
等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的电泳介质来分离等电点(pI)不同的蛋白质的电泳技术。这是六十年代后期才发展起来的新技术，基本原理是在制备聚丙烯胺胶凝胶时，在胶的混合液中加入载体两性电解质(商品名Ampholine)。这种载体两性电解质是一系列含有不同比例氨基及羧基的氨羧酸混合物，其分子量在300～1000范围内，它们在pH2.5～11.0之间具有依次递变但相距很近的等电点，并且在水溶液中能够充分溶解。含有载体两性电解质的凝胶，当通以直流电时，载体两性电解质即形成一个从正极到负极连续增加的pH梯度。如果把蛋白质加人此体系中进行电泳时，不同的蛋白质即移动并聚焦于相当其等电点的位置。好的载体两性电解质应具有以下特点：在等电点处有足够的缓冲能力，不易被样品等改变其pH梯度；必须有均匀的足够高的电导，以便使一定的电流通过；分子量不宜太大，便于快速形成梯度并从被分离的高分子物质中除去；不与被分离物质发生化学反应或使之变性等。Ampholine是一种常用的载体两性电解质。要取得满意的等电聚焦电泳分离结果，除有好的载体两性电解质外，还应有抗对流的措施，使已分离的蛋白质区带不致发生再混合。要消除这种现象，办法之一加入抗对流介质，用得最多的抗对流支持介质是聚丙烯酰胺凝胶。
等电聚焦电泳与其它区带电泳比较具有更高的分辨率，等电点仅差0.01pH的物质即可分开；具有更好的浓缩效应，很稀的样品也可进行分离，并且可直接测出蛋白质的等电点。所以此技术在高分子物质的分离、提纯和鉴定中的应用日益广泛。但是等电聚焦电泳技术要求有稳定的pH梯度和使用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质易发生沉淀。