一、实验目的
1.深入了解蛋白质的变性作用的含义。
2.掌握常用蛋白质变性剂的种类。
二、实验原理
天然蛋自质分子中的肽链以一定的方式盘绕曲折，形成特定的构象。这种构象的维持，主要依赖于蛋白质分子中的氢键。尿素能破坏氢键，导致蛋白质分子结构松弛，使蛋白质变性，变性后，蛋白质的肽链就伸展开来，从而使原来包藏在分子内部的－SH 暴露，能与巯基试剂作用，在一定范围内，暴露的－SH 随着变性程度的加深而增加，因此测定－SH 的增加，可衡量蛋自质的变性程度。在碱性条件下，－SH 可被亚硝基铁氰化钠N[Fe(NO)(CN)5]2-氧化成－S－S(二硫键)，氧化剂的铁由高价还原成低价，其配合物呈红色。
产生红色配合物的量与－SH 量成正比，可用比色法(520nm)测定，由于－SH 在重金属离子催化下，易被空气氧所氧化，故在反应体系中加入少许氧化物抑制这种反应。
三、仪器、原料和试剂
仪器
试管 1.5cm×15cm(×27)、刻度试管5.0m1(×18)、 吸管0.10mL(×l)、0.50mL(×4)、l.0mL(×2)、
5.0m1(×l)、电子天平、722 型(或7220 型)分光光度计、容量瓶10mL(×l)。
原料
卵清蛋白或其他蛋白质样品
试剂
1. 2％卵清蛋白液：称取0.5g 卵清蛋白，溶于蒸馏水①(为了减少蛋白质变性，溶解时只能用玻棒轻缓搅动。)离心去除不溶物，取上清液加水稀释至25mL 。
2. 尿素(A.R.)：粉末状。
3. 半恍氨酸盐酸溶液(Cys-HCl)：准确称取半胱氨酸盐酸盐15.76mg 于10.0mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用时，取此液0.5mL，用蒸馏水稀释至10.0mL ，此稀释液每毫升含Cys-HCl0.5μmol。
4. 饱和氯化钠(A.R.)溶液
5. 0.067mol/LNaCN-1.5mol/LNa2CO3溶液：称取3.28gNaCN(A.R.)和 159gNNa2CO3(A.R.)，溶于蒸馏水并稀释至1 000mL。
6. 2％亚硝基铁氰化钠溶液：称取亚硝基铁氰化钠(A.R.)2g，溶于蒸馏水并稀释至100mL。
四、操作步骤
(一)－SH 标准曲线的绘制
取干净试管9支，按下表编号并加人试剂。
摇匀比色。颜色在15s 内稳定，操作要快。不能等各管都加好显色剂后再测定，应加一管测一管。
根据半胧氨酸盐酸盐溶液浓度以及每管加入量，计算各－SH 个数，将此数字及测得吸光度值填表。以－SH 个数为横坐标，吸光度值为纵坐标作图即得标准曲线。
(二)蛋白质变性程度的测定(以测得的 -SH 量表示)
取5.0mL 刻度试管18支，分别对照及测定两组，对照组按0～8编号组，测定组按0ˊ～8ˊ编号。于对照组0～8号刻度试管中，依次加入尿素0、0.8、1.0、 l.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2g，各加蒸
馏水少许，待尿素溶解后，加水至刻度。于测定组0ˊ～8ˊ号刻度试管中依次加入尿素0 、0.8、1.0、l .2、1.4、1.6 、1.8 、2.0、 2.2g。
再各加卵清蛋白液2.0mL，尿素溶解后，放置45min，各加水至刻度。另取18支试管，亦分对照及测定两组，对照组亦编以0～8，测定组编以0ˊ～8ˊ号。各管皆加入饱和NaCl 溶液3.0mL 以及0.067mol/LNaCN~1.5mol/LNa2CO3溶液0.5mL。
从前18支刻度试管中各取出1.0mL 溶液，分别加入相同编号的后18支试管内，然后向每管加入2%亚硝基铁氰化溶液0.5mL ，立即摇匀比色(520nm)，操作时间不得超过15s。比色时，各以本组的零号管调零。
将测定组0ˊ～8ˊ各管之吸光度值减去对照组中相应号码管的吸光度值。对照标准曲线求得各管的一SH 个数。以一SH 个数为纵坐标，尿素量为横坐标作图，并解释所得结果。