蛋白质印迹(western-blot)

实验原理
印迹法一般由凝胶电泳；样品的印迹和固定化；各种灵敏的检测手段如抗体、抗原反应等三大实验部分组成。
1.生物大分子凝胶电泳分离　蛋白质印迹法的第一步一般是将蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺平板凝胶电泳，使待测蛋白质在电泳中按相对分子质量大小在板状胶上排列。
2.分子区带的转移和固定　第二步就是反凝胶电泳已分离的分子区带转移并固定到一种特殊的载体上，使之形成稳定的、经得起各种处理并容易检出的，即容易和各自的特异性配体结合的固定化生物大分子。
3.特异性谱带的检出　印迹在载体上的特异抗原的检出依赖于抗体、抗原的亲合反应。即将酶、荧光素或同位素标记的特异蛋白分别偶联在此特异抗体的二抗上，再分别用底物直接显色，测荧光，放射自显影等方法检测出我们感兴趣的抗原，考虑到如果无合适抗体用来检测抗原时，可用一般的蛋白染料，如丽春红，检测转移到膜上的蛋白，验证转移是否成功。

实验步骤
I　SDS－PAGE电泳分离蛋白
II　电转移
1.戴手套将硝酸纤维素纸裁成和需印迹凝胶相似而略大的小块。
2.将SDS－PAGE后准备印迹的凝胶块和硝酸纤维素纸分别放入装有印迹缓冲液的小塑料盒里漂洗10 min。
3.将滤纸裁成比凝胶和硝酸纤维素纸略大的小块，并做成“三明治”状，放入转移夹中。
4.印迹槽中倒入印迹液，将印迹夹放入，胶朝负极，NC膜朝正极，印迹时电流从负极到正极，即将膜上的蛋白质印迹到NC膜上。
5.电印迹：接通电源，使电流达300 mA，同时通冷凝水，印迹2小时后，切断电源。
III　特异性谱带的检出（当无特异抗体时可用此方法）
NC膜的染色和脱色：
1.印迹完毕，用镊子小心取出NC纸，放置于塑料盒中。
2.用丽春红染色5分钟，用水轻轻漂洗数次至背景红色消失。