差减cDNA文库法-1

[第一条链cDNA合成]
1.合成第一条cDNA链时，所有试剂应按下列顺序依次加入：
10×第一条链合成缓冲液5.0μl
10mMdNTPMix(1.4μg/μl)2.5μl(终浓度1.25mM)
Linkerprimer(1.4μl，终浓度100μg/μl)
DEPcH2O
RNaseblockⅡ(1U/μl)1.0
mRNA1~5μg
混合，离心20秒钟，室温放置10分钟
2.加入逆转录酶至1500U/ml，补水到终体积50μl。
3.混合，取出5μl 放入含有0.5μgα-32PdATP（800Ci/mM），分别保温在37℃1小时。
4.保温后，带有同位素的离心管放入-20℃保存，为以后分析用。第一条链cDNA混合物放在冰上。

[第二条cDNA链的合成]

0.1MDTT8.0μl
10mMdNTPMix3.0μl
α-32PdATP（800Ci/mM）1.0μl
ddH2O115.0μl
2.混合后，加入：
RNaseH(4.0U/μl)1.0μl
DNA聚合酶（10.0U/μl）7.0μl
第二条链反应体积200μl，在16℃水中保温2.5小时，注意水温不得超过16℃，保温后立即放在冰上。
3.反应混合物随后用酚，氯仿提取
4. 用乙醇沉淀于，-20℃过夜。
5.次日，在4℃，以最大速度离心1小时。
6.用80%乙醇洗一次。
7.冷冻干燥cDNA。
8.最后沉淀物溶于43.5μl的ddH2O，取出4.5μl存入冰箱，作为第二条链分析用。

[填补cDNA末端]
1.在39μl的cDNA溶液中加入:5.0μl的10×T4DNA聚合酶缓冲液，2.5mMdNTP混合物。
2.反应物在37℃保温30分钟。
3.酚，氯仿提取。
4.酒精沉淀cDNA，-20℃至少沉淀30分钟。
5. 在台式离心机中，以最大速度4℃离心60分钟。
6.80%乙醇洗涤沉淀。
7.冷冻干燥cDNA沉淀。

[连接]
1.在反应总体积10μl中，应有：
1μl10×连接缓冲液
1μl10mMATP
1μl(4WeissU/μl)
T4DNA连接酶，连接子或者Adapter
2.反应在8℃保温过夜。
3.保温后，反应离心管放于70℃30分钟，以灭活 DNA连接酶。