cDNA文库的构建-3

接头-衔接子与cDNA的连接
8.将下列试剂加入到已削成平末端的DNA中：
10×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 2μl
800~1000 ng 的磷酸化接头或衔接子 2μl
T4噬菌体DNA连接酶（105 Weiss单位/ml） 1μl
10 mmol/L ATP 2μl
混匀后，在16℃温育8~12h。
9.从反应液中吸出0.5μl贮存于4℃，其余反应液于68℃加热15min以灭活连接酶。

[阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA]
Sepharose CL-4B柱的制备
1.用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1ml灭菌吸管端部，用无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去，再用滤过的压缩空气将余下的棉拭子吹至吸管狭窄端。
2. 将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连，将吸管宽端浸于含有0.1 mol/L NaCl的TE（pH7.6）溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置的锥瓶相接。轻缓抽吸，直至吸管内充满缓冲液，用止血钳关闭软管。
3.在吸管宽端接一段乙烯泡沫管，让糊状物静置数分钟，放开止血钳，当缓冲液从吸管滴落时，层析柱亦随之形成。如有必要，可加入更多的Sepharose CL-4B，直至填充基质几乎充满吸管为止。
4.将几倍柱床体积的含0.1 mol/L氯化钠的TE(pH7.6)洗涤柱子。洗柱完成后，关闭柱子底部的软管。
依据大小分离回收DNA
5.用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上层的液体，将cDNA加到柱上（体积50μl或更小），放开止血钳，使cDNA进入凝胶。用 50μl TE(pH7.6)洗涤盛装cDNA的微量离心管，将洗液亦加于柱上。用含0.1 mol/L NaCl的TE(pH7.6)充满泡沫管。
6. 用手提式小型探测器监测cDNA流经柱子的进程。放射性cDNA流到柱长2/3时，开始用微量离心管收集，每管2滴，直至将所有放射性洗脱出柱为止。
7. 用切仑科夫计数器测量每管的放射性活性。
8.从每一管中取出一小份，以末端标记的已知大小（0.2kb~5kb）的DNA片断作标准参照物，通过1%琼脂凝胶电泳进行分析，将各管余下部分贮存于-20℃，直至获得琼脂糖凝胶电泳的放射自显影片。
9.电泳后将凝胶移至一张 Whatman 3MM滤纸上，盖上一张Saran包装膜，并在凝胶干燥器上干燥。干燥过程前20min至30min于50℃加热凝胶，然后停止加热，在真空状态继续干燥1~2h.
10. 置-70℃加增感屏对干燥的凝胶继续X射线曝光。
11. 在cDNA长度≥500bp的收集管中，加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和二倍体积的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀，用微量离心机于4℃以 12 000g离心15min，以回收沉淀的cDNA。
12. 将DNA溶于总体积为20μl的10 mmol/L Tris- HCl(pH7.6)中。
13. 测定每一小份放射性活度。算出选定的组分中所得到的总放射性活度值。计算可用于λ噬菌体臂相连接的DNA总量。
[选定组分的总活度值(cpm)/掺入到第二链的活度值(cpm)]*2xμg cDNA第二链合成量=可用于连接的cDNA [阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接]
1.按下述方法建立4组连接-包装反应：

连接	A(μl)	B(μl)	C(μl)	D(μl)
λ噬菌体DNA(0.5μg/μl)	1.0	1.0	1.0	1.0
10×T4DNA连接酶缓冲液	1.0	1.0	1.0	1.0
cDNA	0 ng	5 ng	10 ng	50 ng
T4噬菌体DNA连接酶（105 Weiss单位/ml）	0.1	0.1	0.1	0.1
10 mmol/L ATP	1.0	1.0	1.0	1.0
加H2O至	10	10	10	10

连接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA储存于-20℃。
2.按包装提取物厂商提供的方法，从每组连接反应物中取5μl包装到噬菌体颗粒中。
3.包装反应完成后，在各反应混合物中加入0.5ml SM培养基。
4.预备适当的大肠杆菌株新鲜过夜培养物，包装混合物做 100倍稀释，各取10μl和100μl涂板，于37℃或42℃培养8~12小时。
5.计算重组噬菌斑和非重组噬菌斑，连接反应A不应产生重组噬菌斑，而连接反应B、C和D应产生数目递增的重组噬菌斑。
6.根据重组噬菌斑的数目，计算cDNA的克隆效率。 7.挑取12个重组λ噬菌体空斑，小规模培养裂解物并制备DNA，以供适当的限制性内切核酸酶消化。
8.通过1%琼脂凝胶电泳分析cDNA插入物的大小，用长度范围500bp~5kb的DNA片段作为分子质量参照