cDNA的筛选-3

免疫学染色
1.为了洗去顶层琼脂上的残余物和细胞碎片，将硝酸纤维素滤膜一次最多5张转移放在摇床上的盘子（10×10cm）内，用25ml TBS室温洗涤10 min 2次。
2.然后滤膜用25ml封闭缓冲液（每张90mm直径的滤膜至少15ml）于室温温育 30min，以封闭滤膜上的非特异性结合位点。不断晃动以防滤膜互相粘在一起。
3.每张滤膜置佩特里平皿中，各用3ml含预吸附第一抗体的封闭缓冲液温育。多克隆第一抗体的经典工作稀释度为1：100。抗体的这种工作稀释度可以重复使用到5次并于4℃保存。室温下用第一抗体温育至少2h。为了确保滤膜仍然完全浸泡在抗体溶液中，温育过程中，将平皿放在摇动平台上。
4.室温下用25ml TBT洗膜3次，每次10min，并不断摇动以除去未结合第一抗体。
5.本步骤操作同步骤3。3ml封闭缓冲液内预吸附第二抗体的工作稀释度通常为1：2000（如过氧化物酶偶联羊抗兔抗体，Calbiochem公司）。第二抗体工作溶液使用不得超过一次。第二次使用后，第二抗体工作溶液的吸附能力似乎耗尽，经常导致阳性信号的突然丢失。
6.用25ml TBS于室温下摇动洗膜3次，每次10min以除去未结合的第二抗体。
7.在一个塑料盘内，45ml冷（4℃）的酶反应缓冲液与5ml冷（－20℃）的氯萘酚和50μl H2O2混合。将滤膜一次最多5张放在显影液内并缓慢搅动。几分钟内阳性噬菌斑显示出紫红色。
8.如果用Polaroid摄影术（665型胶卷，光圈4.5，快门速度1/15，橙色滤光片）记录结果，将硝酸纤维素膜放在曝光箱内。
9.为了有助于挑取阳性菌体斑，在拍照的透明胶片上用针头做相应的标记。

噬菌斑纯化
1.用一支消毒的钝头巴斯德吸管刺入对应于阳性菌体斑位置的顶层琼脂，通常很容易从平板上取下薄的环状顶层琼脂并用 0.5ml λ-dil重悬于一支Eppendorf管内。
2.挑取的噬菌斑所含的噬菌体颗粒通过剧烈的旋涡振荡至少1h，从顶层琼脂释出，在再次铺平板前，新制备的噬菌体悬液置室温下至少1h。
3.在10－3至10－5范围内稀释的噬菌体悬液重悬筛选阳性信号。
4.重复步骤1至3，直到从一个原始噬菌体感染在顶层琼脂上挑取一个阳性噬菌斑为止。

噬菌体增殖
1.为了获取高滴度的均一噬菌体悬液，每个噬菌斑噬菌体悬液取150μl至250μl，加入E.coli Y1088铺平板以便扩增。
2.于42℃ 过夜培养后，每噬菌体克隆的一个平板裂解物用7ml λ-dil覆盖，于室温持续摇动5h提取噬菌体颗粒。
3.用一支消毒的10ml移液管吸取含噬菌体的上清液，小心避免细胞碎片。加入几滴氯仿，上清液可作为噬菌体贮存液于4℃无限期保存。
4.每毫升悬液噬菌体原种滴度应在109～1010噬菌体颗粒范围内。如果噬菌体原种未包含足够的噬菌体，重复步骤1～3，直至达到足够的噬菌体滴度为止。
5.必须通过对高度稀释的噬菌体原种（最多几百个噬菌体）再次铺平板测试噬菌体原种的均一性，并用探针重新筛选。至少99％的测试的噬菌体是阳性才能认定测试的噬菌体原种是“均一的”。

（四）噬菌体颗粒纯化，DNA分离和亚克隆
1.准备10个LB平板，用E.coli Y1088铺平板，每个平板至少105个噬菌体。42℃温育过夜。
2.含噬菌体上清液按前述方法制备，从所有平板收集上清液（10×5ml）。
3.将收集的上清分成两份 25ml分装于40ml聚丙烯离心管内。
4.加入25μl RNA酶A和DNA酶I完全消化细菌核酸，于室温放置30min。
5.每管加入1.46g NaCl并使之完全溶解，室温放置1h后，于4℃以10 000r/min离心10 min除去细胞碎片。
6.将上清转入一干净40ml聚丙烯离心管，加入2.5g PEG，于室温持续搅拌30min使其完全溶解，置冰上过夜PEG促使噬菌体颗粒形成沉淀。
7.于 4℃以10 000r/min离心10min回收沉淀的噬菌体颗粒。
8.弃上清液，小心用软纸擦拭离心管内壁。
9.将来源于同一噬菌体克隆的两份沉淀物用4ml SM重悬并收集。用5ml移液管上下抽吸使乳状沉淀物混匀。
10. 加4ml氯仿，旋涡振荡30秒，去除 PEG；于4℃以1 600×g离心15min。
11. 将水相（顶层）转移至一干净的12ml聚丙烯管内，用SM精确地调节体积至4ml。弃去胶状的有机相和中间相。
12. 在一支14ml polyallomer超离心管（Kontron公司）内，氯化铯分级梯度的制备从底层至顶层：3ml氯化铯密度为ρ＝1.7；1.5ml（ρ＝1.5）；1.5ml（ρ＝1.45）。
13.每4ml SM噬菌体悬液溶解2g固体氯化铯。
14.将噬菌体悬液置氯化铯分级梯度上，在Backman SW40转头或相当的转头上以30 000r/min于4℃离心2h。
15. 小心从转头内取出离心管，放在强光下。此时噬菌体颗粒清晰可见呈乳状条带位于1.5和1.45密度区的中间相。用18G针头从离心管旁侧刺入，以收集噬菌体颗粒。约1.5ml体积。
16.用SM将收集的样品体积升至6ml，加入固体氯化铯（通常约3g）直到溶液的折射率精确为1.380。样品体积进一步用氯化铯溶液（0.75g/ml）扩至终体积为9.5ml。
17.噬菌体颗粒通过持续密度滴度再次离心。
18.如步骤15 收集噬菌体颗粒，用于以标准步骤抽提DNA。