cDNA文库的构建-2

10. Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的dNTP和 cDNA分开。
11. 加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的cDNA，将样品置于冰上至少15分钟，然后在微量离心机上以最大速度4℃离心15分钟，回收沉淀DNA。用手提微型监测仪检查，是否所有放射性都沉淀下来。
12. 用 70%乙醇洗涤沉淀物，重复离心。
13. 小心吸出所有液体，空气干燥沉淀物。
14. 如果需要用EcoR I甲基化酶对cDNA进行甲基化，可将cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)溶液中。另外，如果要将cDNA直接与Not I或Sal I接头或寡核苷酸衔接子相连，可将 cDNA悬浮在29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，尽快进行cDNA合成的下一步骤。

[阶段 3：cDNA的甲基化]
1.在cDNA样品中加入以下试剂：
2 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 5μl
5 mol/L NaCl 2μl
0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2μl
20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1μl
加H2O至 96μl
2.取出两小份样品（各2μl）至0.5ml微量离心管中，分别编为1号和 2号，置于冰上。
3.在余下的反应混合液中加入2μl EcoR I 甲基化酶（80 000单位/ml），保存在0℃直至步骤4完成。
4. 再从大体积的反应液中吸出另外两小分样品（各2μl）至0.5ml微量离心管中，分别编为3号和4号。
5.在所有四小份样品（来自步骤2和步骤 4）加入100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA。这些未甲基化的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率。
6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃温育1h。
7.于68℃加热15min，用酚：氯仿抽提大体积反应液一次，再用氯仿抽提一次。
8. 在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，混匀后贮存于-20℃直至获得小样反应结果。
9.按下述方法分析4个小样对照反应：
a. 在每一对照反应中分别加入：
0.1 mol/L MgCl2 2μl
10×EcoR I 缓冲液 2μl
加H2O至 20μl
b. 在2号和4号反应管中分别加入20单位EcoR I。
c. 四个对照样品于37℃温育1h，通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
10. 微量离心机以最大速度离心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。弃上清，加入200μl 70%乙醇洗涤沉淀，重复离心。
11. 用手提式微型探测器检查是否所有放射性物质均被沉淀。小心吸出乙醇，在空气中晾干沉淀，然后将DNA溶于29μl TE（pH8.0）。
12. 尽可能快地进行cDNA合成的下一阶段。

[阶段4：接头或衔接子的连接]
cDNA末端的削平
1.cDNA样品于68℃加热5 min。
2.将 cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂：
5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10μl
dNTP溶液，每种 5 mmol/L 5μl
加H2O至 50μl
3.加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位 /ml），37℃温育15min。
4.加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，以终止反应。
5.用酚：氯仿抽提，再通过Sephadex G-50离心柱层析，除去未掺入的dNTP。
6.在柱流出液中加入0.1倍体积的3 mol/L 乙酸钠（pH5.2）和二倍体积的乙醇，样品于4℃至少放置15 min。
7.在微量离心机上以最大速度离心15 min(4℃)，回收沉淀的cDNA。沉淀经空气干燥后溶于13μl的10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0).