差减cDNA文库法-3

[大量制备生产单链噬菌体DNA]
1.新鲜过夜培养的宿主菌XLI-Blue，以1：20稀释在LB培养液中，在37℃培养扩增2小时。
2.加1ml含单链cDNA的上清液。
3.再于37℃继续培养2小时。
4.然后将全部溶液转到500~1000mlLB中，生长5~6小时。
5.9500rpm离心60分钟，除去细菌碎片。
6.向上清液中加等体积的 20%PEG，3.5M醋酸胺溶液，室温下沉淀30分钟。
7.9500rpm离心45分钟，把PEG沉淀悬浮在含有405mg/ml的SM溶液中，23℃35000rpm离心16~24小时，在管上部附近，噬菌斑会形成一个可见带，针刺法收集可见带，并对SM溶液透析，最后以酚、氯仿抽提，酒精沉淀噬菌体DNA。

[生物素标记]
1.取来自一个文库的单链cDNA，先用生物素标记后，再与另一个不加生物素标记的cDNA以10：1进行杂交。
2.生物素标记物来自VectorLaboratories，取100μg的单链 DNA溶解在HE缓冲液中，HE缓冲液为：10mMHEPESpH7.5,1MEDTA.
3.100μg/ml超声粉碎。
4.酒精沉淀，溶解在100μlHE缓冲液中。
5.DNA与100μl重组的Photoprobe生物素充分混合。
6.然后暴露在275W的太阳灯下15分钟，混合物与照射距离灯10cm，再重复一次，共30分钟。
7.混合物用正丁醇抽提4次。
8.乙醇沉淀，沉淀物再悬浮于 100μlHE缓冲液中。

[差减杂交]
1.100μg的生物素标记的单链cDNA与另一个文库的10μg的未经生物素标记的单链cDNA乙醇共沉淀。
2.加入：5μgPolyA(Pharmacia),5μgPolyC(Pharmacia)，溶解在10μlHE缓冲液中。
3.把这10μl混合物加到10μl杂交混合物中，此杂交混合物含有：
1.5mNaCl
50mMHEPESpH7.5
10mMEDTA
0.2%SDS
总共20μl
4.把样品紧紧地封在一个硅化过的0.75μl的微量离心管中。
5.煮沸1分钟后。
6.浸在68℃ 水中20小时。
7.杂交后的差减物用Streptavidin-Phenol提取除去杂交的DNA。
8.用乙醇沉淀后再悬浮于 20μl2mMTrispH7.5+0.1MEDTA溶液中。
9.取5μl单链cDNA，加：
5pmole的引物1μl
引物粘合缓冲液（20mMTrispH7.5,50mMNaCl）2μl
H2O2μl
总体积为10μl
10.68℃ 保温10分钟，使引物和cDNA粘合，再慢慢冷却至低于30℃，大约需要2小时。
11.10μl的体积稀释到50μl的反应缓冲液中，反应缓冲液组成为：10mMTrispH7.5,7mMMgCl2,1mMDTT,50mMdNTP。
12.加10单位的Klenow聚合酶，37℃保温2小时。
13.反应物用于转化大肠杆菌。转化用LB琼脂糖平板，琼脂平板含有：50μg/ml青霉素，50μl2%的X- gal，100μl0.1MIPTG。
14.用无菌牙签挑出所有白色菌落，于96孔板中，每孔中含有100μlLB培养液并含有 100μg/ml青霉素。
15.把96孔板用石蜡膜包好，在37℃摇动过夜。
16.第二天，在每孔中加入100μl高压效度过的 50%甘油，再回37℃摇动1小时，96孔板保存在-80℃冷冻箱，稳定1~2年，这就是差减后的cDNA文库。