一、培养的贴壁原代细胞的蛋白质抽提基本步骤 1、从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。 2、预冷的1PBS（pH 7.4）清洗贴壁的细胞2次，小心倾去PBS。 3、蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5l蛋白酶抑制剂混合液\5lPMSF和5l磷酸酶混合液等等）。 4、细胞瓶中加入...

⑦ 再固定：加固定液8ml，混匀，固定10min。 ⑧ 离心：同上，吸去上清液。 ⑨ 制细胞悬液：根据细胞量多少，加入适量固定液，充分混匀，制成细胞悬液。 ⑩ 滴片：取出预先经冰水浸泡的载玻片，用吸管吸取混匀的细胞悬液在离冰片约30cm距离进行滴片，每片约滴2...

一、 人外周血染色体制备 1. 实验原理 人的外周血淋巴细胞培养方法是1960年由Moorhead 提出来的。正常情况下，人外周血小淋巴细胞都处在G1期（或G0期），但在体外给予一定的条件，进行培养，经72 h就可获得大量的有丝分裂细胞。这种取材简易、用血量少的培养...

细胞凋亡的检测方法，从大类上还可以分为早期检测、晚期检测和mRNA水平的检测。 一、早期检测 1、PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测 2、细胞内氧化还原状态改变的检测 3、细胞色素C的定位检测 4、线粒体膜电位变化的检测 二、 晚期检测 1、TUNEL 2、LM-PC...

4、检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法 原理：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine， PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中（图3）。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂...

DNA聚合酶或Klenow大片段介导的原位缺口平移（ISNT） 切片常规脱蜡，梯度乙醇复水化。 将切片组织浸入2SSC液中，80℃，20min，然后蒸馏水冲...

4、DNA 5末端32P标记 （1）将脱磷酸样品DNA置冰浴上，再加双蒸水10l，10缓冲液2l，T4多核苷酸激酶10U，32P-ATP 740kBq（20Ci），双蒸水加至20l。 （2）混合后，37℃水浴60min。 （3）加入1l的0.5mol/L EDTA，90℃灭活5min。 5、观测 （1）取一定量的标记DNA稀...

方法三 （1）收集细胞悬液（106细胞），低速离心（1000r/min，离心5min）。 （2）去上清，沉淀加0.4ml低渗缓冲液作用1h。 （3）13 000r/min，离心10min，将上清转移至另一Eppendorf管中，加等量50％异丙醇和0.5mol/L NaCl混匀，置液氮5min。 （4）12 000r/min...

一、形态学检测 （一）光学显微镜和倒置显微镜 1、未染色细胞 凋亡细胞的体积变...

2、RT-PCR法检测细胞bcl-2 mRNA的表达： （1）总RNA提取： 为了获得高质量的真核细胞mRNA，必须使用RNA酶抑制剂。操作过程中应避免RNA酶污染器材和试剂，因此所有剥离、塑料器材先用0.1%DEPC水溶液浸泡12h，然后用无菌的新鲜蒸馏水淋洗数次，塑料器材应采用高...