大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另...
结晶紫法活性测定 1、取对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞，用0.25%胰酶（以无钙镁离子PBS溶液配制，pH7.4）消化后，加入RPMI-1640培养基（10%新生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，pH7.2）吹打细胞，使形成细胞悬液。进行细胞计数，使细胞数为2~2.5105个...
原理 目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以...
一、实验目的 在DNA上以限制性内切酶的酶切位点作为标记所绘制的物理图谱就是限制性内切酶图谱，限制性内切酶图谱与其他相关资料联合使用，可用于基因克...
一、实验目的 学习和掌握基因重组以及外源基因在大肠杆菌中诱导表达的方法。 二、实验原理 通过基因重组可将外源基因导入细胞，并使之进行扩增或表达。在生命科学的研究中，基因重组已经不仅是研究的目的（如基因工程的上游工程），而且日益成为一项重要的研...
实验步骤： （1）诱导靶蛋白表达 分别挑取对照菌和重组菌1~2个菌落，接入5ml含Amp（30g/ml）的LB培养液，37℃振荡培养过夜。 取5ml过夜培养物接入500ml含Amp（30g/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2h以上，至对数中期（A550=0.5~1.0）。 向诱导管中加入IPTG使其...
（2）质粒的提取及酶切鉴定分析 质粒的提取按照质粒提取试剂盒的操作步骤进行，然后进行双酶切鉴定。 管号 ① ② 质粒DNA 10l 10l BamHⅠ 1l 0l BamHⅠ Buffer（10） 2l 2l SalⅠ 2l 0l ddH 2 O 5l 8l 加样后混匀，置于37℃水浴中，保温3~4h。然后每个管中加...
实验步骤： （1）目的基因与表达载体的连接反应： ①表达载体和目的片段的酶切 管号 ① ② pGEX 4T-1 42l PCR产物 42l BamHⅠBuffer（10） 5l 5l BamHⅠ 1l 1l SalⅠ 2l 2l 加样后混匀，置于37℃水浴中，保温3~4h。然后将酶切产物全部经琼脂糖凝胶电泳后回收...
动物组织RNA的提取 实验目的：掌握由动物组织中提取总RNA的方法 实验原理：Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液，其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性，随后加入氯仿，酚会大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DN...
二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化 1. NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液洗涤。 2. 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻...