小鼠β-actin基因的克隆表达（3）

质粒的提取按照质粒提取试剂盒的操作步骤进行，然后进行双酶切鉴定。

加样后混匀，置于37℃水浴中，保温3~4h。然后每个管中加入4μl Loading buffer终止反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

Southern 杂交
实验目的：学习通过Southern 杂交鉴定目的基因的方法

实验原理：将DNA经限制性内切酶消化成一系列片段，进行琼脂糖凝胶电泳，各片段因分子量不同而彼此分开，然后经碱处理凝胶，使DNA的片段被变性、中和并通过毛细作用在高盐缓冲液中在原位将单链核酸转印到硝酸纤维膜上，烘干、固定。然后用被标记的探针与其杂交，再通过显影技术观察杂交结果。

实验步骤：

（1）探针的标记

① 用灭菌去离子水稀释1μg DNA至总体积16μl。

② DNA热变性： DNA沸水浴10min，然后迅速插入碎冰中3min以上。

③ 加4μl DIG Random Labeling Mix（高效），混匀后2000rmp离心5min。

④ 置于37℃反应至少120min。时间越长，产量越高。延长反应时间至20h可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。

⑤ 加入2μl EDTA以终止反应，-20℃保存。

（2）Southern转移

① 将目的基因经琼脂糖凝胶电泳的胶板从电泳槽中取出，用蒸馏水漂洗20～30min。

② 把凝胶浸入变性液中，室温浸泡15min×2次。

③ 蒸馏水漂洗凝胶2次。

④ 把凝胶浸入中和液中，室温泡15min×2次。

⑤ 处理凝胶的同时，切一张同样大小的尼龙膜或者硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜用2×SSC浸泡。剪两张Whatman 3mm滤纸（或相当的）和吸水用的粗滤纸。注意不要用手直接触及膜面。

⑥ 准备转移用平盘和支架，平盘中放20×SSC，支架上搭滤纸桥，依次放置：滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸、吸水纸和玻璃板。在玻璃板上压一500～1000g的重物。

⑦ 室温下转移12～20h。

⑧ 取出转移膜，用2×SSC漂洗数次，以去除可能吸附在膜上的凝胶。

⑨硝酸纤维素膜置于普通烘箱中80℃烘烤2h进行固定。
（3） Southern杂交

① 将转移好的尼龙膜或硝酸纤维素膜装入杂交管中，贴壁放置（吸附有核酸的一面不要贴壁），赶走杂交膜和管壁间的气泡。

② 加入20ml 预杂交液，65℃预杂交4～20h。

③ 将制备的DNA探针沸水浴加热10min，然后迅速插入冰中，全部加入杂交管。

④ 使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16～20h。

⑤ 杂交结束后将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20℃以备下次使用。这样至少可以保存一年。再次使用前，应在冻融后加热至95℃使探针10min变性。

⑥ 取出杂交膜，用Wash SolutionⅠ洗3次膜，每次5min。

⑦ 保温冲洗：用 Wash SolutionⅡ于68℃冲洗2次膜，每次15min。

（4） BCIP/NBT 显色检测法

① 经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1min。

② 用干净的平皿，封闭液室温封闭至少60min。

③ 用封闭液1：2500～5000稀释 Anti-DIG-AP，例如2μl Anti-DIG-AP加至5～10ml封闭液中（根据染色情况而调整）。稀释液4℃可稳定12h左右。

④ 加Anti-DIG-AP，37℃反应60min。

⑤ 分别用100ml冲洗液洗3次膜，每次15min。

⑥ 按1：50配制底物显色液：例如100μl “BCIP/NBT储备液”加至5ml显色缓冲液中，未用完的显色剂应避光保存。

⑦ 用20ml显色缓冲液将膜平衡2min后取出。

⑧ 在平皿或杂交袋中加10ml底物显色液（6×6cm），将膜浸入显色剂中避光显色。显色过程中可以观察，一般数分钟即开始出现颜色，显色过程可以持续至12h。应绝对避免震动，以免出现颜色带的移位。

⑨ 当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以终止反应。结果可以进行照相记录；也可以直接保存于TE缓冲液，在此情况下，颜色长期不退。还有一种选择是让膜干燥，颜色消褪。但若将膜放置于TE缓冲液中，显色重新出现。

（5）结果分析

具体分析Southern杂交结果。
目的基因诱导表达和蛋白分离纯化
实验目的：掌握目的基因诱导表达和目的蛋白分离纯化的原理和方法

实验原理：

pGEX-4T-1上携带的是trp-lac启动子，亦称tac启动子。它是一个双启动子，或称杂合启动子。tac 启动子是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子。由trp启动子加上lac操纵子中的操纵基因、SD顺序融合而成。整个tac启动子受lac阻抑物调控，在lac阻抑物高水平表达的lacl大肠杆菌菌株中，其转录可被抑制，加入异丙基硫代半乳糖苷(1PTG)可诱导其表达。

经诱导表达的蛋白是包括谷光甘肽巯基转移酶（GST）和目的蛋白的融合蛋白，将粗蛋白通过连接有还原型谷光甘肽的色谱柱进行亲和层析，由于融合蛋白上的GST能够与还原型谷光甘肽进行结合，所以就可以将目的蛋白从粗蛋白中纯化出来。