小鼠β-actin基因的克隆表达（2）

实验步骤：

 

（1）目的基因与表达载体的连接反应：

①表达载体和目的片段的酶切

 

管号	①	②
pGEX 4T-1	42μl
PCR产物		42μl
BamHⅠBuffer（10×）	5μl	5μl
BamHⅠ	1μl	1μl
SalⅠ	2μl	2μl

 

加样后混匀，置于37℃水浴中，保温3~4h。然后将酶切产物全部经琼脂糖凝胶电泳后回收。

②表达载体与目的片段的连接

取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：

2×buffer： 5 μl

pGEX 4T-1酶切回收产物： 1 μl

Pfu扩增并酶切回收的片段： 3μl

T₄连接酶： 1 μl

离心30Sec，使反应体系充分混合，16～22℃连接3～4h。

（2）克隆载体与目的片段的连接

取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：

pMD18-T 1 μl

目的片段 4μll

Solution Ⅰ(含连接酶和buffer) 5 μl

离心30Sec，使反应体系充分混合，4℃过夜连接。

感受态细胞的制备及转化

实验目的：把体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。

实验原理：所谓感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态。关于感受态的本质说法很多。目前主要有两种假说：1.局部原生质体化假说—细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进入细胞。2.酶受体假说—感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。

DNA分子的转化过程如下：1.吸附—完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面。2.转入—双链DNA分子解链。单链DNA进入受体菌，另一条链降解。3.自稳—外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA。表达— 供体基因随同复制子同时复制，并被转录翻译。
实验步骤：

 

（1）感受态的制备

① 从LB平板上挑取单克隆于5ml LB培养基中，37℃ 200rpm摇菌12～16h。

② 将活化过的菌按1～5％的体积比接种到新的LB液体培养基中，37℃ 200rpm摇菌约2h，OD₆₀₀约为0.4。

③ 取1.5ml摇好的菌液于一1.5ml的EP管中，4℃ 4000rpm离心3min，弃上清。

④ 加250µl 0.1M的CaCl₂（灭菌预冷）温和悬浮菌体，4℃ 8000rpm离心1min弃上清。

⑤ 加200µl 0.1M的CaCl₂（灭菌预冷）温和悬浮菌体，为感受态细胞。置于4℃ 存放。

（2）转化

① 将盛有感受态细胞的EP管放置于冰上10min，加入10μl连接产物，温和混匀，冰浴20~30min。

② 42℃热激90S。冰浴5~10min。

③ 加入800μL LB液体培养基，37℃培养45～60min。4000rpm离心2min，弃去800μl上清液，剩余混匀用来涂板。

④ 取含有50～100μg/ml Amp的LB平板培养基（若进行蓝白斑筛选，在培养皿上先涂布4μl 200mg/ml的IPTG和40μl 20mm/ml的X-Gal），涂板。

⑤ 37℃倒置培养16~20h。

克隆的筛选与鉴定

实验目的：掌握快速鉴定阳性克隆的菌落PCR法；了解质粒DNA的制备原理及分类根据，掌握碱变性法质粒DNA小量制备及酶切鉴定的方法

实验原理：碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA、质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节其pH到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被出去。

实验步骤：

（1）菌落PCR鉴定法

待转化的细菌菌落长直径到2mm时，直接用接种针或牙签挑取少许菌体加入30μ的PCR反应体系中。

 

试剂	体积（30μl）
ddH2O	22.5μl
10×buffer	3μl
dNTP	1μl
克隆引物B1	1μl
克隆引物B2	1μl
模板(单菌落)	1个
Taq 酶(2.5u )	0.5μl

 

然后挑取菌落剩余部分，划在培养皿上作好标记的方格内；同时在对应编号的含5ml LB液体培养基的培养管中接种。