小鼠β-actin基因的克隆表达（4）

实验步骤：

（1）诱导靶蛋白表达

分别挑取对照菌和重组菌1~2个菌落，接入5ml含Amp（30μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养过夜。

取5ml过夜培养物接入500ml含Amp（30μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2h以上，至对数中期（A550=0.5~1.0）。

向诱导管中加入IPTG使其浓度达到1mmol/L，28℃振荡培养5h左右取样。

（2）目的蛋白质的分离纯化

样品处理

① 取500ml诱导的培养液，12000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。菌体在-20℃（最好在用液氮或干冰）反复冻融几次，使菌体裂解后呈现黏液状。

② 用针筒将20ml含0.2% Triton X-100和1mmol/L PMSF的PBS强行注入黏的细胞裂解液中，剧烈混匀。加入DNase和RNase至终浓度达5µg/ml，4℃振荡温育10min，4℃ 8000RPM离心出去不溶物，上清液转移至一新管中，加β-巯基乙醇（或DTT）至终浓度为1mmol/L。

上清液需用0.45µm滤膜过滤，以防止堵塞柱子。Triton X-100可防止蛋白聚集，DTT或β-巯基乙醇可使GST保持还原状态。

蛋白纯化

① 在注射器（或恒流泵的导管）中充满结合缓冲液，排除气泡。打开亲和柱出口，连接注射器和柱子，以10个柱床体积的结合缓冲液（PBS）平衡柱子，流速控制在1ml/min。

② 用注射器上样，流速控制在0.2～1ml/min，上样量约为2个柱床体积。

③ 用5～10个柱床体积的PBS洗脱未结合蛋白，流速1ml/min（或检测没有蛋白流出为止）。

④ 用2个柱床体积的洗脱缓冲液目的蛋白，流速1ml/min，在洗脱流出液达到0.5ml后开始收集目的蛋白。

⑤ 结合力低的柱子可用2个柱床体积2M的盐酸胍洗柱子后，立即用5个柱床体积的结合缓冲液洗柱子，以达到再生的目的。

⑥柱子储存在4℃下的20％乙醇中。
Western Blotting
实验目的：掌握Western Blotting的操作流程和通过Western Blotting鉴定目的蛋白的方法

实验原理：

SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.其分离原理是根据蛋白质的分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT)，其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构，SDS 是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级及三级结构，并与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，电泳样品假如样品缓冲液后，要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时，蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化，蛋白质也完全变性和解聚，并形成榛状结构，稳定的存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基，然后根据抗原－抗体结合原理及显影技术就可以确定表达的蛋白是否为目的蛋白
实验步骤：

 

(1) 电泳

① 准备步骤

将凝胶板水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。梳子临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在灌胶架上。

按下表配制适合浓度的分离胶，摇匀后迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，小心在胶上覆盖一层95%的乙醇。

 

	10%(ml)
H2O	4.10
29%Acr+1%Bis	3.34
4×分离胶缓冲液(pH8.8)	2.50
10% SDS	0.05
TEMED	0.02
10%过硫酸铵	0.02
总体积	10ml

 

在分离胶聚合的过程（约30min）中，按下表配制5%的浓缩胶，注意TEMED应在灌胶前才加入。

 

H2O 3.675（ml） 29%Acr+1%Bis 0.65 8×浓缩胶缓冲液(pH6.8) 0.625 10% SDS 0.05 TEMED 0.05 10%过硫酸铵 0.05 总体积 5ml

 

分离胶聚合完全后，倒去乙醇，用滤纸吸干胶面上的残余水。

灌注浓缩胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。

浓缩胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。将胶板固定于电泳槽上，上下槽各加入电极缓冲液。

② 上样

将实验11获得的蛋白溶液按1：1比例加入2×SDS上样缓冲液混合，100℃沸水浴10min。10000rpm离心1min，置冰上用上清液来点样电泳。

用微量进样器加样，每个点样孔中加入20µl样品，同时点蛋白marker。每次应洗涤加样器，最后在空白加样孔中加入等体积的SDS样品溶解液。

③ 电泳

装好冷凝水系统，打开电源，电压为100V，电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。

④ 染色：从电泳装置上卸下胶板，小心橇开玻板取出凝胶，将胶板放入考马斯亮蓝R250染色液中染色2h以上。

⑤ 脱色：移出凝胶放入脱色液中脱色至本底无色为止。根据电泳结果分析诱导菌株有无表达目的基因。

(2) 杂交

① 将电泳后的胶板取出，裁取和胶等大的硝酸纤维素膜，按照：海绵-滤纸-胶-硝酸纤维素膜-滤纸-海绵的顺序装入电转印槽中，注意硝酸纤维素膜一定要朝向正极一侧。

② 加入转膜缓冲液，放在冰水浴中60V电压（150mA）转印2h。（整个过程应带手套操作）

③取出硝酸纤维素膜用TBS冲洗一次。室温下，在脱色摇床上用含10%脱脂奶粉的TBS封闭硝酸纤维素膜1h。倒掉封闭液，用TTBS(含0.1%的吐温-20)洗膜10min。

④取1μl anti-GST单克隆抗体（一抗），稀释在500μl含少量脱脂奶粉（2%的奶粉）的TTBS（含吐温-20，0.05%）中，将稀释的一抗均匀点在一干净的塑料膜（长和宽大约分别是膜的2.5倍和1.5倍）上，要求点一抗的面积同硝酸纤维素膜等大。小心地将硝酸纤维素膜有蛋白一侧铺在一抗上，注意排除气泡，同时保持湿度。25℃放置2h（或4℃过夜）。

⑤ 用TBS洗膜2次，用TTBS（含吐温-20，0.05%）洗1次，每次需持续约10min。

⑥ 取1μl goat-anti-mouse-IgG-HRP（二抗），稀释在500μl含2%的奶粉的TTBS（含吐温-20，0.05%）中，同样，将稀释的二抗均匀点在一干净的塑料膜上。小心地将硝酸纤维素膜有蛋白一侧铺在二抗上，注意排除气泡，同时保持湿度。25℃放置1h。

⑦ TTBS（含吐温-20，0.05%）洗膜4~5次，每次5min，将硝酸纤维素膜装入杂交袋中，

⑧ 在EP管中按1ml BAD增强剂兑50µl DAB配制显色液，配好的显色液避光保存，30min内有效。

⑨在杂交袋中加入显色液，室温下显色2～30min，当有清晰的棕褐色条带出现时，用水冲洗硝酸纤维素膜终止反应，观察并分析结果，干燥保存。