基因重组以及外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

一、实验目的

学习和掌握基因重组以及外源基因在大肠杆菌中诱导表达的方法。

二、实验原理

通过基因重组可将外源基因导入细胞，并使之进行扩增或表达。在生命科学的研究中，基因重组已经不仅是研究的目的（如基因工程的上游工程），而且日益成为一项重要的研究手段（如基因功能研究中将研究对象基因单独分离后重组，可以研究其表达、调控过程以及功能等），所以有着不可替代的地位。本实验通过最基本的流程进行重组操作，目的是使外源基因在大肠杆菌中进行表达；有条件的话，可以进行表达条件的优化，筛选出高效的稳定的表达工程菌。

外源基因（可通过PCR，化学合成或直接从自然材料中分离方法获得）被克隆在Lac启动子下游，与表达质粒载体连接构成重组体，经CaCl2法转化导入受体大肠杆菌细胞内。当培养基含有IPTG（异丙基硫代-β-D半乳糖）时，Lac启动子被诱导而启动其下游基因进行表达，从而在大肠杆菌细胞中产生外源基因产物。通过电泳可检测表达产物蛋白的存在并估计其表达量，也可以通过检测表达产物的生物活性从而了解产物的有效性。

三、材料、试剂及器具

1、材料

含外源基因片段的保存质粒

2、试剂

（1）染色液、脱色液、2×上样缓冲液等

（2）IPTC

（3）表达质粒载体

3、器具

蛋白质电泳用的聚丙烯酰胶凝胶电泳系统

四、实验内容

本实验可拆分小综合实验：（1）重组和检测;(2)诱导表达和表达产物的检测；（3）生物活性检测和高表达菌株的筛选

(一)重组

1、按实验39的方法用一种（或用两种不同的）限制性内切酶酶切表达载体；用同样的限制性内切酶酶切含外源基因片段的保存质粒，然后 回收外源基因片段（若提供的材料是可以直接使用的外源基因片段，则不需从质粒上切割、回收）。

回收方法：①1.5ml的大离心管内套一个小的0.5ml的离心管，小离心管底戳一小洞，然后填上少量的硅烷化的玻璃纤维。整个二连系统灭菌备用.

在紫外光照射下（注意防护），迅速从电泳凝胶上切下含所需的带，放入二连系统的小管内。稍戳碎琼脂凝胶，加入适量TE。反复冻融几次，使琼脂糖结构破坏释放DNA，并溶于TE中。离心使TE（含DNA）通过小孔进入大离心管内，而大部分琼脂糖被玻璃纤维阻隔在小离心管中。对打离心管中的溶液纯化处理可得所需的DNA片段。

2、连接表达载体和外源基因。

3、连接产物经灭活连接酶活性后转化大肠杆菌感受态细胞。

4、筛选并初步鉴定阳性重组子：根据转化子的辨别转化子与非转化子；快速筛选重组子。

5、对初筛的重组子做进一步检测。

 

（二）诱导表达

筛选到的阳性重组子菌株

↓

用LB培养基在37℃培养过夜

↓

以1%的比例接种至100ml的表达用培养基中

↓

37℃培养至OD≈0.7-0.8

↓

加入 50μl 1mol/L IPTG （终浓度0.5nmol/L）

↓

37℃,振摇培养一段时间

↓

4℃，低温离心，收集菌体备用

（三） SDS-PAGE检测蛋白

1、配制分离胶

①架好胶板，用1.5nm胶条在两边隔开，用夹子固定，并用封底胶封底约 1cm

表50-1不同浓度的凝胶的成分和用量 单位（ml）

 

凝胶浓度（%）	7.5	10	12	15	18	20
双蒸水1.5mol/L	9.6	8.1	6.7	4.7	2.7	1.5
Tris。 HCL（PH8.8）	5	5	5	5	5	5
10% （w/v） SDS	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
Acr/Bis(30%)	5	6.65	8	12	12	13.2
TEMED	10	10	10	10	10	10
10%Aps	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1

 

表50-2 4 %分离胶的配制成分

 

成分	用量
双蒸水	6.1ml
0.5mol/L Tris。 HCL（PH6.8）	2.5ml
10% （w/v）SDS	100μl
Acr/Bis(30%)	1.3ml
TEMED	10μl
10%Aps	50μl
总体积	10ml

 

②配制分离胶

根据被分离的外源蛋白的相对分子质量选择凝胶浓度，将所有成分混匀后加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水，约40min，等胶自然凝聚后倾斜倒出蒸馏水，并在两玻璃夹缝中水平插入1.5mn的梳子（在胶面上加入蒸馏水称水封，其目的是保持胶面平整和防止空气进入，影响凝胶）。

2、 按表50-2配制4%的浓缩胶

所有成分混匀后加入到夹缝中，并没过梳齿，待凝固后小心拔出梳子，用 100μl微量注射器抽取电极缓冲液冲洗梳子拔出后的加样凹槽底部，清除未凝的丙烯酰胺。

3、样品制备

菌体样品与2×上样缓冲液1：1混匀，并在100℃沸水浴中保温3min- 5min，取出待用。

4、 电泳

（四）生物活性检测

(五)高表达菌株的筛选

五、注意事项

1、实验前必须查阅有关参考书籍和资料，写出可行的实验步骤，了解有关数据、配制剂和培养基、灭菌等后方可开始实验。

2、实验中使用有毒（如EB）时必须注意防护，勿将毒物污染实验人员、实验室等。