[实验原理] 把含有外源基因的表达载体转化的大肠杆菌在有相应抗菌素和诱导物的条件下培养，可以诱导外源蛋白在大肠杆菌中表达。利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方法将诱导培养的细菌的细胞壁破碎后，可使那些可溶性的外源蛋白释放出来，再利用硫酸铵沉淀...
附录一 培养基 LB： Tryptone 10g 1% Yeast Extract 5g 0.5% NaCl 5g 0.5% 【Agar】 15g 1.5%（固体培养基另加） dH 2 O稀释至1L，高压灭菌 YPD ： Yeast Extract 10g 1% Peptone 20g 2% 【Arga】 20g 2％（固体培养基另加） dH 2 O 900ml 高压灭菌，冷却至6...
一．质粒酶切及线性化 1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10g/3ml菌液，终体积80ul。 2）线性化质粒 使用80l酶切体系 9KSF2质粒 70l 内切酶（SacI， SalI， BglⅡ） 2l 10 x buffer 8l 3）酶切3－16小时，一般3小时即可； 二．乙...
12、蛋白降解 分泌表达的目标蛋白比胞内蛋白确实容易被降解。可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，4～7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物（比如酵母酸）；3、摸索最适下罐（摇瓶也一样），宁可少...
1、 菌株 用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。 2、温度： 在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。 3、pH 手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的pH7.0-7.5比较合适。国内外做的最好的rHSA，最适pH大概 5-6左右...
随着PCR技术的不断发展成熟（扩增长度、保证性、产量和特异性等），质粒构建过程的大多数细胞内的DNA复制将被PCR这一细胞外的DNA复制所代替，质粒构建效率将有质的飞跃。 4.4密码子的偏好性的原则 酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。了解...
3.5 Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法 3.5.1 模板的处理： 1. 平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）； 2. 将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物，或者或者一条使用载体上的引物，一条使用基因...
三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD...
液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。 2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）： yeast extract 1% peptone 2% dextrose (glucose) 2% so...
一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制 1．1 各种母液的配制 10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基） 4℃保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。 500*B （0.02%生物素 Biotin） 4℃保存 保存...