12、蛋白降解
分泌表达的目标蛋白比胞内蛋白确实容易被降解。可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，4～7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物（比如酵母酸）；3、摸索最适下罐（摇瓶也一样），宁可少表达点也别给降解光了。实在没办法，只好换菌株或做pcr突变酶切位点（当然不能影响表达和蛋白活性）。
Several strategies have been reported as effective in minimizing the proteolytic instability of specific foreign proteins secreted into the P.pastoris culture medium.
1）、The first is adding to the culture medium of amino-acid rich supplement such as peptone or casamino acid, which reduce product degradation possibly by acting as execess substrates for one or more problem proteases.
2）、 The second strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between pH 3.0 and pH7.0.
3）、The third strategy involves elevating the level ofammonium in the culture broth adequately, which is explained by the hypothesis that portease activity is induced under nitrogen starvation.
The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.
连续两个或两个以上的碱性氨基酸相邻的结构，如果有的话，在这一位点是很容易被蛋白酶切断，产生偏小的多肽。
13、换液
通常用BMGY和BMMY是要换液的，但也可以不用换液。培养到菌液浑浊后，直接向BMGY里加甲醇诱导就行了。GS115在第4天达到了最高表达量。换液不是必要的，适量甘油的存在有时反而会使表达量提高，
10ml生长培养后，等体积换液。我用250三角瓶，装量25mlBMGY发酵2天，再取0.5ml加入BMMY（250三角瓶，装量25ml)中诱导发酵.
BMGY和BMMY的换液方式有2种：
1）一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。另外2）一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶在无菌室静止4小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留。
是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。
总之，无论是取样还是补料、加甲醇，尽量用灭菌的移液管（因为比较长，不容易引起污染）。当然，微量的如200ul，还是用移液器加（快而准确），可以在瓶口处往瓶内加入100％甲醇等。用新开启的分析纯甲醇，我们都没有过滤或者其他处理，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取加入摇瓶就可以了。实验室里也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。
14、上罐表达
放罐时OD能达到400左右，生长过程最高OD500左右，重组蛋白发酵水平大约300-400mg/L。30g/L甘油初始培养OD约40左右，流加约420g/L甘油后，菌体密度达到最高约500。开始诱导后，起初3－5h之内流加的甲醇很少，发酵体积变化小，但是菌体的OD值是快速下降的，一般是原来的90%左右，每次都是这样，确切原因我们也还不清楚，估计是酵母从高速生长转向营养饥饿过程中，菌体形态发生很大变化，比如大小、含水量、折光率等。随酵母逐渐适应利用甲醇为碳源，mut＋型酵母的诱导可以将甲醇的流速逐步提高，此时仍然能发现OD值下降，我们认为这主要是发酵体积增加的原因造成的。我们诱导过程一般增加约40%的体积7L到10L，最终OD值约为最高OD值的80%左右，简单换算一下，应该知道菌体生物量增加约1/7。其实，这和毕赤酵母代谢甲醇途径也是一致的，甲醇首先被氧化成甲醛，一部分继续氧化成甲酸进而生成CO2，产生菌体所需的能量，另一部分可以被菌体同化，进入小分子碳架的合成途径，提供菌体生长所需的碳源。
15、菌体密度：
菌体是在BMMY中培养的，可以不用BMMY做对照，在600nm处测OD值，培养基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。
麦芽浸提液培养酵母（不换液，补料），生长阶段结束后，密度可达到10-12，诱导培养结束后，密度可达到18左右。
如果用1体积的BMGY，在生长阶段结束后，换液时，加入1/10——1/2体积的BMMY进行诱导培养（即浓缩培养），细胞密度也可达到20以上。
通常，真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OD600可达到40-60及以上。摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。
摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。
17、菌种保存
用15%甘油做保护剂，-70度长期保存，-20度短期保存使用。不过要注意冻存前一定充分混匀，酵母菌体很容易沉降到EP管底部，保存效果大打折扣。
一般OD2-6的YPD过夜菌吸取300ul菌液到灭菌的ＥＰ管然后加等体积的甘油，混匀，放于－２０度．保存长的话最好放－８０度冰箱。
重组菌株传代次数太多，确实可能存在菌株退化的现象。这在用动物细胞表达系统如CHO，NS0系统更为明显，所以一定要保存好最原始的重组菌株，每次从中划板，挑单克隆表达，尽量减少菌株传代次数。不行的话再用相同的方法重新转化筛选高表达菌株。
GS115的鉴定方法
接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。GS115的 his4基因突变了，不能在组胺酸缺陷型培养基上生长，一般的YPD培养基营养丰富，什么都有了，而YNB却只含基本氮源，GS115应该在上面不长，就是从YPD上挑菌落，在YNB和补充了HIS的平板上对应的点一下，在HIS上长而YNB上不长的是GS115，这样能挑到纯的，以防突变。
附：TCA沉淀方法；ELISA protocol；原位双膜法快速检测阳性表达株：
TCA沉淀方法
培养基上清直接电泳跑出来的条带经常很难看，可以TCA沉淀浓缩后跑电泳，。表达上清很少有直接考染能看得到条带的， 1ml表达上清浓缩到20ul直接电泳。一般表达量大于1mg/ml可以看到明显条带，但重复性不好。
具体步骤：
1.菌液10000g,离心5分钟，收集表达上清。
2.取500-1000ul上清于EP管中，加入1/9体积的100％TCA，颠倒10次混匀。
3.样品置于冰浴中大于0.5小时，过夜效果更好。
4.15000g,离心10－20分钟,可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。
5.将EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱10－20分钟，待管底无明显液体残留，如果管壁还残留有液体，可以吸水纸吸掉。可以改成室温或用电吹风，关键是除去管底和管壁残余液体。
6.15000g,离心10－20分钟,用20ul枪头尽量吸去管底残余的液体，此步骤要快，不然沉淀容易散开，降低蛋白回收率，一般最多几ul或者没有，注意不要吸到沉淀。
7.EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱5分钟，确认管壁和管底没有液体残留。
8.加入20－50ul Loading buffer，95度加热10nim，一般沉淀会自动溶解，如果不溶，用手指轻弹管壁或用20ul枪头轻轻吸打，注意整个操作尽量不要碰到管壁，因为管壁可能沾有残余TCA。如果蓝色的Loading buffer不变成黄色，说明残余TCA吸弃了干净，如果变黄，一般不影响电泳。此方法连丙酮洗这一步都省了，而且不影响电泳效果。
或者第5步和第6步改为丙酮洗:
5.加入200ul冰冷的丙酮，用手指轻弹EP管，洗去管底和管壁残余的TCA。
6.15000g,离心10－20分钟,倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。
样品是酵母细胞超声后离心获得的上清，用Loading buffer溶解蛋白沉淀，始终不能溶解，而且加热超过10分钟以后也依旧不溶解。Typtone做TCA沉淀效果不好，沉淀很多，颜色是绿的，不好溶，Peptone沉淀是黑色的，比较少，一般用丙酮洗一步后很好溶。沉淀不溶，很可能是TCA没有除干净）
ELISA protocol：
用BMMY培养基一般表达1－2天收集表达上清，稀释一定比例铺板做ELISA检测
1.取5－10ul BMMY表达上清用0.05M NaHCO3稀释到100ul铺ELISA板，37度或室温振荡大于1小时。注意一定要做一个GS115空菌株表达上清作为阴性对照，最好还找一个带有 histag的蛋白作为阳性对照。
2.TPBS洗板3次，方法：倒掉铺板液，倒置于毛巾上轻轻拍打几次，加TPBS至满，重复。
3.加封闭液（TPBS加1％脱脂奶粉）350ml/孔，室温下放置40分钟－1小时，TPBS洗3次。
4.加封闭液稀释的histag一抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS洗3次。很多公司都有histag的单抗，个人觉得Qiagen和Pharmacia单抗较好，Invitrogen和Labvision的一般般，一般1：1000－5000稀释，不同公司的抗体效价不同。
5.加封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS洗3次。二抗很多公司有，国产的华美都可以，1：500－1000。如果是HRP标记的histag抗体，不加二抗直接显色。
6.加入OPD显色液100ul/孔，避光反应约10－30分钟。显色液配方：1mg/ml OPD于0.1M 柠檬酸钠，PH5.5，0.1%H2O2，－20度避光保存。也可以用DAB显色。
7.1M H2SO4 100ul/孔终止反应，酶标仪测OD490nm。
TCA沉淀考染看不到条带，可以打算作ELISA，但可能上清里面杂蛋白太多，抗原（目的蛋白）不可能包被到板子上，所以几乎不可能检测到的。他们建议作点杂交，就是把少许上清点到PVDF膜上，以后就按照western blot 就可以了。ELISA使用多抗，意义不是很大，因为确实阴性对照也显色，和阳性结果差不了太多，特别是蛋白表达水平不高的话，两者区别很不明显，一抗是自己制备的多抗,空白值在0.2左右,阴性对照(即空白宿主自身表达的上清)OD值大约在0.35-0.4之间,目的蛋白测的值却在0.6-0.65.可见效果还是比较明显的.因为是多抗阴性对照难免会对结果产生影响.没有单抗也只能这样了.
原位双膜法快速检测阳性表达株：
1） 将醋酸纤维素薄膜置于MD/His -平板的His + 转化子菌落上,用涂布棒轻压使醋酸纤维素薄膜完全湿润并赶尽气泡, 使所有菌落转移到醋酸纤维素薄膜上.
2) 在BMMY板上置一同样大小的硝酸纤维素薄膜, 并将醋酸纤维素薄膜菌落向上置于硝酸纤维素薄膜上. 30 ℃孵育18 h 后, 将醋酸纤维素薄膜移至MDP2His 平板上, 4 ℃保存
3) 将硝酸纤维素薄膜取下, 6 %小牛血清37 ℃封闭2 h , TBS-T ( Tris-NaCl 缓冲液加0105 %吐温20) 洗3 次( 每次10 min) . 加一抗室温孵育2 h , TBS－T 洗膜3 次. 然后二抗室温孵育2 h , TBS2T 洗膜3 次. 最后显色。
在强弱不等的颜色中挑选染色最强的克隆，做诱导表达进一步验证。操作时，一定要记好位置，以免不能将膜上的克隆和板上的克隆对上。
纤维素膜的选择根据？都用醋酸膜行吗？
以后的步骤就基本上是做western，所以用硝酸纤维素膜通过虹吸将醋酸纤维素膜上的菌落分泌的液体转到硝酸膜上，相当于western的转膜过程。