1、 菌株
用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。
2、温度：
在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。
3、pH
手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的pH7.0-7.5比较合适。国内外做的最好的rHSA，最适pH大概 5-6左右。pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。
4、偏爱密码子
codon bias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大（30KD以上），结构复杂（如一些蛋白酶），二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。
5、表达时间与空质粒转化对照
诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。最好做一个空质粒转化的对照，这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。
6、污染
每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml，余1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。
污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。加盖报纸后，就再没遇到过污染。如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml 三角瓶，装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。
7、不表达
蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。
8、表达量
30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5－10倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。
9、糖基化
酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的，有如下序列：N X S/T就是潜在的糖基化位点，X为任意氨基酸，1个糖基化位点会加上1－3KD左右的糖基。另外可能还有O糖基化话，但是无法预测其位点，不过很少听说表达蛋白有O糖基化的。如果胞内表达，不存在糖基化的问题。
10、表型与表达
重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换，结果就是产生Mut+和Muts表型的菌株；前者在甲醇诱导表达时生长快，消耗的甲醇多，后者生长慢，消耗的甲醇少，所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多，但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好，只有试试才知道你的蛋白用那种菌株表达较好。
11、培养基
YPD：最基本的培养用；BMGY：诱导表达前培养用；BMMY：诱导表达用；MD：电转化后筛选his＋用。
YEPD是不能代替BMGY的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把 YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。
BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。
YNB可以高压灭菌，没问题的，也可以0.22um过滤处理，天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入；配YPD时可以加入YPD一起灭菌，但时间不能太长，温度不能太高，一般121-125度12-15分钟足够了。若时间过长，温度过高，可能导致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压灭菌。
小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除，培养基价格便宜，操作又方便，可以直接灭菌，效果也很好（效果不比含YNB的差）。
如果是用自己配置的培养基，如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提液等等，可以不用换液，采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。
用无机盐进行大规模发酵，更省钱。
大规模发酵时，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用纯氧并不昂贵，在武汉买个钢瓶600元左右，一瓶纯氧20元。一个批次100h左右估计3－4 瓶氧气。
关于Tryptone和Peptone的选择：
1）用培养E.coli的Tryptone替代Peptone对有些酵母菌可以,例如一般的表达酵母.但是对有酵母菌些绝对不行.例如做双杂交的 AH109,Y187之类表达酵母，根本就长不好．
2）Tryptone和Peptone虽然都是营养胨，但营养成分不一样．即使是一般的表达酵母可以在Tryptone生长，生长状态也没有在 Peptone中好．但tryptone和peptone就是含量上有点不同外，其他没什么区别，用peptone的目的不是为了提供氮源，提供氮源的是培养基里面的YNB。
3）如果要求不高，一般使用也还凑合．尽可能的用Peptone，difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它国产的蛋白胨都可以很正常的培养绝大多数酵母菌．
4）用含Peptone的培养基颜色很深，纯化表达蛋白时颜色要去掉，所以还要进行麻烦的后续处理。而改用Tryptone后，培养基颜色变得很浅，和LB（液体）颜色差不多，后续处理要简单些。invitrogen说明书说 peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶类水解，加入peptone的目的就是竞争性抑制目的蛋白的水解，因为peptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。
培养毕赤酵母,书上说BIOTIN储液是水溶液,但事实上BIOTIN很难溶于水, 可以稍稍水浴加热一下。配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：
1）、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；
2）、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；
3）、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。MD、MM属于基础培养基，没有哪种成分会含有微量生长因子（如生物素）。所以肯定要加的。
附：无机培养基配方
BSM无机培养基：
85% H3PO4 26.7ml/L
CaSO4 ·2H2O 0.93g/L
K2SO4 18.2g/L
MgSO4·2H2O 14.9g/L
KOH 4.13g/L
甘油 40g/L
PMT1 4.0ml/L
100%氨水调pH5.0(1瓶50ml加800ul氨水)或10g/L硫酸铵调pH5.0，氨水用于上罐调pH（便宜，方便）。诱导表达前调 pH6.0。pH5.0是为了防止BSM形成磷酸钙沉淀，pH6.0是表达HSA融合蛋白的最适pH。
BSM高压灭菌后再加4.0ml/L 过滤除菌的PTM1(微量元素)4.0ml/L 。100%的500ml甲醇加6ml PMT1，用于补加甲醇诱导表达目的融合蛋白。
PMT1（1L）配方：
CuSO4·5H2O 6.0g/L
KI 0.088g/L
MnSO4·H2O 3.0g/L
Na2MoO4·2H2O 0.2g/L
H3BO3 0.02g/L
CoCl2·6H2O 0.5g/L
ZnCl2 20.0g/L
FeSO4·7H2O 65.0g/L
Biotin 0.2g/L
浓H2SO4 5.0ml