2026 EBF 建议：配体结合分析的单孔分析 —— 生物标志物和抗药物抗体分析（更新版）

文献全称：An update on the European Bioanalysis Forum recommendation on singlicate analysis for ligand‑binding assays: biomarker and anti‑drug‑antibody assays，2026‑03‑26 发表，EBF（欧洲生物分析论坛），承接既往 PK‑LBA 单孔建议，拓展至生物标志物、抗药物抗体 ADA 免疫原性检测，对齐 ICH‑M10 框架。 核心立场：复孔检测属于历史行业惯例，并非监管强制要求；在方法学性能充分验证前提下，单孔（singlicate）可作为默认方案Taylor & F...。

一、背景

1. 传统 LBA（配体结合分析）普遍采用样本复孔测定、报告均值，源于早期试剂、板件、平台变异大；现行监管指导原则（ICH M10）只要求方法可靠、适用用途，未强制要求样本复孔。
2. EBF 此前已验证 PK（药物浓度）LBA 可采用单孔；本文件将适用范围扩展至生物标志物定量、ADA（筛选‑确认‑滴度）全套免疫原性检测。
3. 多企业联合验证数据集：合计 > 66 000 样本，覆盖 23 个生物标志物、91 个 ADA 检测，多基质、多物种、多平台（MSD、ELISA、RIA、AlphaLISA）。
   • 生物标志物：单孔 vs 复孔整体偏差‑0.16%，99.44% 样本差异＜20%；
   • ADA：整体偏差‑0.18%，99.80% 样本差异＜20%；
   • AlphaLISA 平台变异性相对更高，需重点评估，其余主流平台一致性优异。

二、核心定义

1. 单孔分析 singlicate analysis：一份待测样本仅点 1 个反应孔，直接读取结果，不做同一样本多孔重复。
2. 复孔 duplicate：同一样本制备后点 2 孔，取均值报告。
3. 用途适配性 Fit‑for‑Purpose：样本孔数选择必须结合方法性能、数据下游决策风险，在方法开发阶段论证并书面留存，供监管审阅。

注意：校准标样、QC 质控样本不强制单孔，仍可保留复孔，不与样本单孔策略冲突。本建议针对研究待测样本，不改变校准 / QC 的验证实验设计。

三、适用与不适用场景

✅ 支持采用单孔的场景（经充分方法学验证）

1. 生物标志物 LBA 定量检测；
2. ADA 免疫原性整套流程：筛选实验、确认实验、滴度测定；
3. 平台：MSD、ELISA、RIA 等稳健体系；
4. 非临床、临床研究样本，支持申报的监管生物分析。

⚠️ 需要审慎评估、优先保留复孔的情形

1. AlphaLISA 等固有变异性偏高平台；
2. 方法开发阶段精密度差、板间 / 批内变异大；
3. 数据用于高风险关键决策，且方法性能边界接近可接受限；
4. 低浓度靠近 LLOQ、信号‑噪声比很差的体系。

不是禁止单孔，而是需要更充分的比对数据证明单孔足够可靠；证据不足则继续用复孔。

四、方法开发与验证阶段的关键要求（EBF 强推荐）

1. 开展单孔‑复孔比对试验 在方法开发阶段，使用真实基质样本覆盖整个定量范围（LLOQ 到 ULOQ），包含低、中、高浓度，评估单孔与复孔结果一致性；统计指标：偏差、百分比差异、符合可接受标准的样本占比。
2. 评估批内、批间精密度，证明单孔模式下方法整体性能满足项目接受标准。
3. 文档化论证：将 “选择单孔的科学依据” 写入方法 SOP、验证报告，说明平台特性、比对数据、下游数据风险，供监管核查。
4. 不允许直接照搬其他项目的单孔结论，每个检测方法独立评估。

五、样本分析运行时系统适用性与异常处理

1. 校准标样、QC、系统适用性对照仍按既定方案执行，可继续使用复孔；
2. 单孔模式下，不通过重复点样来补救异常样本；
3. 出现板故障、可疑信号、系统适用性失败：整板作废重测，而不是对个别样本复测复孔；
4. 保留原始信号、原始读数，完整可追溯。

关键：单孔不是 “减少质控”，而是将重复的价值从 “样本孔重复” 转移到方法开发充分验证、系统适用性、QC 体系、板完整性控制。

六、ADA 免疫原性检测的专项要点

1. ADA 筛选、确认、滴度均可采用单孔，前提是开发阶段完成单‑复孔比对；
2. 滴度终点判读、cut‑point 计算不受单孔 / 复孔策略影响，cut‑point 验证照常开展；
3. 假阳性 / 假阴性风险评估要纳入单孔模式的不确定性；高风险分子（如具有内源性同源靶点）需更严格的性能验证。

七、生物标志物检测专项要点

1. 内源性生物标志物、药物诱导生物标志物均适用；
2. 基质效应、LLOQ、ISR（实测样本重现性）验证照常；
3. 靠近 LLOQ 的样本，重点评估单孔模式下假阴性 / 假阳性风险。

八、优势与现存局限

优势

• 降低试剂消耗、减少人力、提升通量，适配自动化工作站；
• 减少不必要的实验负担，加速药物研发；
• 与 ICH‑M10 “用途适配” 原则保持一致。

局限与风险

1. 不能将单孔作为通用默认直接套用所有 LBA；每个方法必须独立数据论证；
2. 平台固有的高变异会被放大，如 AlphaLISA 需重点评估；
3. 没有样本孔重复，无法通过同板复孔识别单孔随机偶发异常，必须强化板级系统适用性。

九、EBF 总体结论（摘要）

1. 现代稳健 LBA 体系下，生物标志物与 ADA 检测的待测样本可以采用单孔分析，单孔与复孔数据具备科学等效性。
2. 样本孔数不应当是行业惯性，应当由方法开发数据 + 下游决策风险驱动；性能达标时，单孔作为待测样本的默认策略。
3. 校准标样、QC、系统适用性对照的复孔设置可维持原有方案，二者不冲突。
4. 全部论证必须书面记录，支持监管递交。

实践提示：该文件为行业专家建议，实验室仍需结合属地监管机构（EMA/FDA/NMPA）的实际审评习惯，在申报前进行充分沟通