胚胎植入前遗传学一体化检测试剂的质量控制技术评价指南

该指南面向PGT‑A（染色体非整倍体）、PGT‑M（单基因病）、PGT‑SR（染色体结构重排）一体化高通量测序检测试剂，用于试剂研发、性能验证、注册申报与实验室质控，覆盖分析前、分析中、分析后全流程质量控制，明确参考品体系、关键性能指标、软硬件、风险与报告要求。 说明：一体化试剂可在一次实验同时完成染色体拷贝数变异、单基因病单体型分析、染色体重排检测，难点在于单细胞微量样本、全基因组扩增偏倚、等位基因脱扣、嵌合体识别、多模块联合质控。

一、适用范围

1. 适用于基于高通量测序的胚胎植入前遗传学一体化检测试剂，检测样本主要为胚胎卵裂球细胞、滋养层细胞；同时开展 PGT‑A、PGT‑M、PGT‑SR 检测。
2. 用于试剂开发的性能评价、企业参考品建立、注册申报资料撰写、临床实验室内部质量控制。
3. 本指南仅为技术评价参考，不替代医疗器械注册法规、国家标准、行业标准与临床遗传咨询规范。

二、术语定义

1. 一体化 PGT 试剂：一套试剂完成全基因组扩增、文库构建，测序后同时输出染色体非整倍体 / CNV、单基因病单体型、染色体结构重排结果。
2. ADO 等位基因脱扣：单细胞扩增时一条亲本等位基因扩增丢失，造成基因型判读错误，是 PGT‑M/SR 主要风险点。
3. 嵌合体：同一胚胎内存在两种及以上核型细胞，分为低、中、高嵌合度；试剂需具备嵌合体识别能力。
4. 信息位点 / 信息窗口：家系连锁分析中可区分亲本单体型的 SNP 位点与基因组窗口。
5. 企业参考品：企业自行制备、赋值、溯源，用于试剂性能验证的参考物质，含阳性、阴性、嵌合体、三倍体、重复性参考品等。

三、试剂设计开发总体要求

3.1 样本与分析前质控

1. 样本类型：卵裂球、滋养层细胞；需明确样本采集、转移、洗涤、保存、运输条件，研究样本冻融耐受、样本稳定性。
2. 单细胞样本风险：样本丢失、污染、细胞裂解不完全；必须设置空白对照，监控环境 DNA 污染。
3. 家系样本要求：PGT‑M/PGT‑SR 必须配套先证者、父母外周血样本，用于构建单体型；需要明确家系样本采集、核酸提取质控标准。

3.2 关键实验模块质控

1. 全基因组扩增（WGA）
   • 评估扩增失败率、扩增均一性、扩增偏倚、ADO 率、空白对照污染。
   • 空白对照人类基因组比对率应设置阈值，排除外源 DNA 污染。
2. 文库构建
   • 文库构建失败率需≤3%；文库片段分布、接头二聚体、引物二聚体必须受控中国食品药...。
3. 测序平台适配
   • 试剂需明确适配测序平台型号；对测序仪、测序试剂、测序参数做确认；不同批次测序运行之间的重复性验证。
4. 生物信息学分析软件
   • 一体化分析软件同时支持：CNV 分析、单体型分型、结构重排分析；软件版本固定，算法、参数可追溯；设置算法阈值，明确假阳性、假阴性来源。
   • 软件需要确认输入输出、过滤条件、判读阈值；软件异常、报错、边界样本处理方案。

四、企业参考品体系建立

一体化 PGT 试剂企业参考品应覆盖 PGT‑A、PGT‑M、PGT‑SR、嵌合体、三倍体、重复性样本，参考品赋值可溯源国家药品监...。

1. PGT‑A 参考品：各类染色体数目异常、≥4Mb 拷贝数缺失 / 重复、阴性正常样本。
2. PGT‑M 参考品：携带致病变异家系模拟样本，包含致病单体型、正常单体型。
3. PGT‑SR 参考品：相互易位、倒位等染色体重排模拟样本。
4. 嵌合体参考品：30%、70% 嵌合度样本，用于嵌合检出能力验证。
5. 三倍体参考品：验证三倍体检出能力。
6. 重复性参考品：用于批内、批间重复性。
7. 空白 / 阴性对照：监控污染。

参考品要求：所有参考品检测符合率 PGT‑A/M‑SR 应达到 100%；嵌合体 30% 嵌合度检出率≥30%，70% 嵌合度检出率≥60%；三倍体全部检出；ADO 率≤10%。

五、核心分析性能指标要求

5.1 建库与测序数据质控

1. 文库构建失败率≤3%。
2. PGT‑A 模块唯一比对有效 reads≥1M，基因组覆盖率≥4%。
3. PGT‑M 连锁分析：目标基因上下游 1Mb 至少 2 个有效信息位点；PGT‑SR 信息窗口覆盖 98% 基因组（端粒、着丝粒、高度重复序列除外）。

5.2 准确性

1. PGT‑A：检出全部非整倍体、≥4Mb 的 CNV；参考品符合率 100%。
2. PGT‑M：正确识别致病单体型，参考品符合率 100%；ADO 率≤10%。
3. PGT‑SR：正确识别重排单体型，参考品符合率 100%。
4. 嵌合体：30% 嵌合度检出率≥30%，70% 嵌合度检出率≥60%。
5. 三倍体样本检出率 100%。
6. 阴性参考品全部判读正常，阴性符合率 100%。

5.3 重复性 / 精密度

同一批次试剂盒检测重复性参考品，多次实验结果符合率 100%；同时完成批内、批间精密度验证。

5.4 特异性与抗干扰

评估外源 DNA 污染、降解样本对结果的影响；设置空白对照上限阈值，排除交叉污染。

5.5 方法学局限性确认

说明书必须写明局限：

1. ADO 造成的 PGT‑M 判读风险；
2. 低比例嵌合体检出受限；
3. 端粒、着丝粒、高度重复区检测局限；
4. 无法排除新发变异；
5. 检测仅为胚胎筛查，不能替代产前诊断。

六、分析后质量控制与报告规范

1. 实验有效性判定规则：每批次实验必须同步运行阳性对照、阴性对照。对照结果异常，整批实验结果无效。
2. 结果判读阈值：明确 CNV 拷贝数阈值、嵌合体判读阈值、单体型分型置信阈值。
3. 报告内容
   • 样本信息、家系信息、实验质控指标（有效数据量、覆盖率、ADO 提示）；
   • PGT‑A 结果：染色体数目、拷贝数变异；
   • PGT‑M 结果：单体型分型，风险提示；
   • PGT‑SR 结果：染色体重排携带状态；
   • 明确标注本检测局限性，提示胚胎移植后建议产前诊断确诊；
   • 遗传咨询建议，不能仅依据 PGT 结果直接决定胚胎取舍。
4. 结果复核流程：异常结果必须双人复核。

七、试剂产品质量控制（成品）

1. 原材料质量控制：WGA 酶、接头、引物、磁珠等关键物料质量标准。
2. 成品稳定性：实时稳定性、开瓶稳定性、冻融稳定性；规定储存条件、有效期、最大冻融次数。
3. 批放行：每批次成品必须使用企业参考品做放行检测，满足性能指标才可放行。

八、临床实验室使用质量控制要点

1. 每轮实验设置：空白对照、阳性质控、阴性质控。
2. 记录关键质控参数：扩增产物浓度、文库质控、测序数据量、比对率、覆盖率。
3. 定期开展室内质控，有条件参加室间质评。
4. 建立样本防污染流程，物理分区；防止样本交叉污染。
5. 结果必须结合家系信息、胚胎形态学，配合遗传咨询，妊娠后建议产前诊断。

九、风险提示

1. 单细胞 PGT 检测固有风险：扩增偏倚、ADO、嵌合体、污染，会造成假阳性、假阴性。
2. 一体化检测结果仅为辅助生殖参考，不可以作为胚胎移植唯一判定依据，后续产前诊断为金标准。
3. 试剂注册申报时，分析性能、企业参考品、软件验证、临床评价资料需要完整提交。

信息仅供技术梳理，不构成注册申报指导文件，注册申报请以 NMPA、中检院官方文件为准