2021 ELN建议：骨髓发育不良的流式细胞术分析—分析前和技术问题

一、分析前关键要点

1. 样本采集
   • 首选首次骨髓抽吸样本，2-3ml；若需更大体积，建议重新定位穿刺针或另选部位穿刺。
   • 抗凝剂优先肝素；EDTA 可接受，但可能影响 CD10、CD11b、CD16、CD64 等抗原表达，尤其延迟处理时。
   • 避免血液稀释，确保样本代表性。
    
2. 样本处理时限与保存
   • 最佳处理时间≤24h；36-72h 内可接受，但需增加质控（如散射特性、抗原表达）。
   • 延迟处理应室温保存 / 运输，避免 4℃冷藏，以防抗原表达改变（如 CD11b、CD16）与细胞散射特性异常。
    
3. 样本制备流程
   • 推荐 “裂解 - 染色 - 洗涤 - 固定” 方案：红细胞裂解后染色，洗涤后用 0.5% 多聚甲醛固定，1h 内上机；若延迟，4℃避光保存不超过 24h。
   • 可选 “免洗裂解” 方案：全骨髓 / 外周血 50-100μl 加抗体，室温 / 4℃避光孵育后裂解红细胞，直接上机，适用于单核细胞或红系评估。
   • 裂解液优先氯化铵，其他商用试剂需平行验证。
    

二、技术核心规范

1. 抗体组合与荧光素选择
   • 核心标志物：CD45、CD34、CD117、CD13、CD33、CD16、CD11b、CD10、CD14、CD56、HLA-DR 等，建议每管≥6 种抗原，确保细胞群纯度。
   • 荧光素搭配：避免亮度不足或光谱重叠；CD11b 推荐 10.1 克隆（如 BV421），CD16 避免洗涤步骤以减少丢失。
   • 克隆与试剂需实验室内部验证，建立参考范围。
    
2. 仪器设置与质控
   • 每日校准：按厂商推荐用校准微球；建议采用 EuroFlow 或 Harmonemia 方案，确保不同仪器 / 实验室数据可比性。
   • 散射与荧光设置：FSC-Height 排除粘连体，时间参数监控获取稳定性。
   • 补偿：定期校验，因细胞群自发荧光差异可能需针对性调整。
    
3. 数据采集标准
   • 每管至少采集 100,000 白细胞，CD34 + 细胞≥250 个；单核细胞分析需≥10,000 个单核细胞，红系分析需≥100,000 个红系细胞。
   • 采集后尽快分析；若延迟，4℃避光保存，避免荧光信号衰减。
    
4. 数据分析要点
   • 设门策略：以 CD45-SSC 圈定细胞群，再针对粒系、单核系、红系、CD34 + 祖细胞分别设门。
   • 异常判定：关注抗原表达强度异常（如 CD117 过表达）、成熟模式紊乱（如粒系 CD11b/CD16 表达延迟）、异常标记（如单核细胞 CD56+）。
   • 参考范围：实验室需自建正常骨髓样本的抗原表达与成熟模式基线。
    

三、常见问题与解决方案

四、临床应用提示

1. 结合形态学、细胞遗传学与分子检测，流式结果不可单独替代形态学分类。
2. 异常免疫表型（如 CD34+CD19 - 祖细胞 > 3%）提示 MDS 可能，但需排除反应性改变（如感染、治疗后）。
3. 单核细胞 CD56 + 需谨慎解读，可能见于 CMML 或反应性单核细胞增多。

五、总结