（1）CaCl2处理以后的转化: 当细菌处于0℃、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此时转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在42℃短时间热冲击后吸附在细胞表面，在丰富培养基中...

重组DNA是在体外用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异地切割，获得的目的基因或DNA片段与载体重新连接，从而组成一个新的DNA杂合分子。重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性增殖，获得大量的目的基因或DNA片段，...

（3）CHO细胞稳定表达系统：动物细胞瞬时表达系统中外源基因没有稳定地整合到宿主细胞染色体中，一染色体外DNA的形式存在。因而只能瞬时表达。要使外源基因在宿主细胞中高效、稳定地表达，必须建立一个稳定表达系统，包括适宜的表达载体、有效的基因转染、标...

（6）遗传标记： 从成千上万个哺乳细胞中，检测出极少数的含DNA重组体的转染细胞，并鉴定已导入外源DNA是哺乳动物细胞基因表达系统的一个关键内容。因此，在真核生物表达载体上必须附有标记基因，才能进行筛...

2.包涵体的分离与纯化 细胞破碎时提取细胞内产物的关键。对于细菌的裂解常用的有酶溶法、超声破碎法、化学渗透法、玻璃珠研磨等。包涵体可通过超声波、匀浆等常规的方法是菌体破碎后，离心就可得到。密度梯度离心后可得到高纯度的包涵体。包涵体一般不溶于水...

通过外源DNA的重组、克...

10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液 200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6) 50mmol/K MgCl2 50mmol/L二硫苏糖醇 500g/ml 牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用） 该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。 另外，再设立两个对照反应，其中含有（1）只有质粒载体；（2）只...

外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA５磷酸和相邻的3羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单...

[器材和试剂] ●大肠杆菌TGl菌株(Stratagen) ●37℃孵育箱(NewBrunswickScientmc) ●Sorvatl RC5离心机(或同类型)，GS3转头(均在4℃预冷) ●预冷的500m1聚丙烯离心管 ●2L有挡板锥形瓶 ●基本培养琼脂板[10 5g K2HP04、4．5gKH2P04、1g(NH4)2S04、 0．5g Na3C...

方法四： 1、将1ml过夜培养的细菌（如DH52、TG1、TM101）接种于100ml2YT培养于500ml烧瓶。于37℃刷烈振荡，通常200rpm培养的细菌密度约OD550=0.2～0.5(5107cells/ml),需2～4h。 2、将培养物放于冰上致冷10min，于4℃离心细菌培养物，10000rpm离心10min。 3、...