DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA 连接...
2． 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。 3． 结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4．PCR的...
2. 连接产物的转化 ⑴ 取100l贮存于-70℃钙化菌，冰浴化开； ⑵ 加入适量连接产物（一般不超过10l，轻轻混匀，冰浴20min； ⑶ 于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min； ⑷ 加入LB液体培养基200l，于37℃缓摇孵育45min； ⑸ 将培养物适量涂于1.5%...
所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。 亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛...
实验题目 ：目的基因的亚克隆 一、实验目的 1、掌握细菌基因组提取的方法和原理。 2、掌握限制性核酸内切酶处理基因组及其结果分析。 3、掌握基因片段回收的方法。 二、实验原理 细菌基因组的提取：通过碱法或者酶法裂解细菌之后，可以将胞内的核酸和蛋白质全...
酶切 直接在回收PCR产物的试管中配置酶切体系： PCR产物酶切－制作插入片断 公用Buffer 6L 酶 I 3L 酶 II 3L PCR产物 双蒸水 48L 合计 60L 要将PCR产物接入的质粒载体A，取A质粒3L进行酶切。 A质粒酶切－制作载体片断 公用Buffer 3L 酶 I 1L 酶 II 1L 质粒 3L...
本方法的核心部分是医科院基础所的生化脂蛋白组的吴刚老师所创，我在其基础上进行了一些改动，主要是DNA回收上采取了更简单的方法。（本方法最适用于双酶切制作片断并进行克隆 的情况。对于分步酶切制作片断，也可以使用本方法，但需要加倍起始酶切DNA的量。...
PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。 平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR 产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR 产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的35外切酶活性和53的聚合酶活性）。...
1. 了解实验课题对目的蛋白的要求 包括：目的蛋白分子量有多大，表达目的（是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体，不同目的对蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞内表达还是分泌表达，是组成型表达还是诱导型表达；另外，还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式...
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA 片段( ＜10kb) 且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化...