DNA重组（DNA recombination）技术：外源基因的蛋白表达-3

（6）遗传标记： 从成千上万个哺乳细胞中，检测出极少数的含DNA重组体的转染细胞，并鉴定已导入外源DNA是哺乳动物细胞基因表达系统的一个关键内容。因此，在真核生物表达载体上必须附有标记基因，才能进行筛选。常用的标记基因有：胸苷激酶基因（thymidine kinase，TK）、二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolate reductase，DHFR）、氯霉素乙酰转移酶基因（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）、新霉素抗性基因（neomycin resistance,NEO）等。
例如新霉素是细菌的抗生素，它可以干扰原核生物的核糖体，使蛋白质合成不能正常进行，而真核细胞核糖体不受新霉素的影响。新霉素的一种类似物G418对真核细胞和原核细胞均有毒性。细菌的新霉素抗性基因与能有效转录的真核DNA序列连锁时，就能在真核细胞中获得有效的表达。NEO基因编码的磷酸转移酶能使G418失活。所以，当细胞表达了这种NEO抗性基因以后就会在含有G418的选择培养基中存活，这种选择系统适用于所有的细胞类型。
2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式
常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式有许多。

不同哺乳动物细胞转染方式及应用

细胞系	DNA转染方式	最初的应用
CV-1	SV40病毒感染	表达野生型、突变蛋白
CV-1/293	腺病毒感染	表达野生型、突变蛋白
COS	瞬时DEAE-葡聚糖	在哺乳类细胞中表达，快速鉴定cDNA克隆，表达突变蛋白。
3T3	逆转录病毒感染	转基因动物，在不同类型细胞中表达
鼠成纤维细胞MOP	瞬时DEAE-葡聚糖	快速鉴定cDNA克隆表达突变蛋白
CHO-DHFR	稳定DHFR+转染 用氨甲喋呤扩增	高效稳定表达
灵长/啮齿类	痘病毒	疫苗
神经元细胞	EB病毒载体 HSV病毒载体	克隆表达 基因转移

3.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统

在哺乳动物细胞表达系统中比较具有代表性的是COS细胞瞬时表达系统和中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster overy cell，CHO）的稳定表达系统。 (1)COS细胞瞬时表达系统： 由COS细胞系和带有SV40复制起始点（SV40 ori）的表达载体组成的。
SV40病毒染宿主细胞后，SV40病毒的早期基因产物—大T抗原作为反式因子与SV40 ori 结合，使宿主细胞的DNA聚合酶不断复制病毒DNA，最后的结果是在宿主细胞感染48小时后，病毒基因组可扩增1000倍。因此，以SV40病毒基因组100bp长的SV40 ori 为基础构建了表达载体，宿主细胞选用COS细胞。
COS细胞源于非洲绿猴细胞系（CV-1）。CV-1细胞经复制起始区缺陷的SV40病毒基因组转化后，产生能表达SV40的大T抗原的COS细胞株。此细胞株除了能持续SV40的大T抗原外，还含有启动带有SV40 ori 的质粒进行复制所必须的所有细胞因子。这样转染到COS细胞的带有SV40 ori 的质粒就可进行快速扩增。每个COS细胞将积累>105个带有SV40 ori 的重组表达质粒，并高效表达外源DNA基因。由于转染的质粒不受约束地复制，直到细胞不能忍受如此大量的DNA在它的染色体外进行复制，最终导致死亡，所以这一系统是瞬时表达系统。
在COS细胞中的表达载体,除了SV40 ori序列以外,还必须含有以下结构:原核DNA复制起始点(ori)及原核可选择性标记,以便表达载体与质粒的构建及在细菌中增殖；真核细胞蛋白质表达元件：包括启动子、增强子、转录后加工的信号序列（能有效得加上polyA）、内含子（带有剪接供体和剪接受体的功能位点）以及转录终止信号序列。以保证真核基因的有效表达；设计一定的限制性内切酶的位点，以便外源目的基因的插入。

pMT2是一个带有SV40ori的瞬时表达载体，见图7-16，可以在COS 细胞中进行瞬时表达。
（2）COS细胞瞬时表达系统的应用： COS细胞瞬时表达系统是研究哺乳类细胞基因表达调控的简便方法。某些原核或真核基因可作为测定哺乳类基因启动子转录活性的基因，将要测定的真核基因表达的调控区克隆与这些基因前，通过研究在不同情况下这些基因的表达水平，来分析基因的表达调控机制。分离编码蛋白质的cDNA是COS细胞瞬时表达系统最有用的作用。从以哺乳类细胞表达载体为基础而制备的cDNA文库中分离分泌蛋白质的编码cDNA，可按以下步骤进行：


带SV40 ori的表达载体在COS细胞中转染以后可得到高水平表达的蛋白质。回收、分析，可用做生物试剂，并可用作蛋白质结构与功能的研究。并可作为对组建的真核基因表达载体的快速评估系统