选择随机定向测定策略的影响因素 （1）计算设备 任何大规模的测序计划将在很大程度上依赖计算机程序对原始序列资料进行分类、整理和排列（Staden，1986）。在权衡随机法的利与弊之时，必须将与适当的计算机设备进行联机的问题放到压倒一切的位置上来考虑。如...
二、Maxam－Gilbert DNA 化学降解法 与包括合成反应的链终止技术不同，Maxam-Gilbert法要对原DNA 进行化学降解。这一方法是在体外研究lac阻抑制与lac操纵基因相互作用时酝酿发展起来的。时至今日，可以探测DNA 构象的蛋白质－DNA 相到作用，仍然是Maxam- Gilb...
３．DNA 聚合酶 通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶，其中包括大肠杆菌DNA 聚合酶I的Klenow片段（Sanger等，1977），反转录酶（见文献，如Mieredorf和Prfeffer，1987）经过修饰消除了 35外节酶活性的T7噬菌体DNA 聚合酶（Sequenase）和测序酶2.0），Ta...
序列测定的技术和策略 Sanger双脱氧链终止法 Maxam－Gilbert DNA 化学降解法 测序策略 目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组...
测定DNA 的核苷酸序列是分析基因结构与功能关系的前提。从小片段重叠法到加减法、双脱氧链终止法、化学降解法、自动测序，DNA 测序技术发展很快。目前在实验室手工测序常用Sanger双脱氧链终止法。Sanger法就是使用DNA 聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA 核苷酸序...
焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。 Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应（参见Pyrosequecing的原理），在每一轮测序反应中，只加入一种d...
3．单链模板的分离 (1)沉淀M13：在上述M13培养物上清中，加入0.2倍体积的3.5mol/L醋酸铵/20%多聚乙二醇溶液，颠倒混匀数次，置冰浴30分钟。离心15-30分钟(11000g)可见白色噬菌体沉淀。小心除去上清液，可将试管倒置并吸去多余液体。 (2)分离纯化模板：向沉淀...
3．制备电泳凝胶及电泳 (1)制备胶模：取双块制胶玻板，先用泡沫海绵沾洗洁净液仔细擦洗，用水彻底淋洗，干燥后继用酒精清洗，晾干，再用硅烷剂(repel- silane)将玻板的面擦一遍，蒸馏水淋洗，干燥 (注意：清洗时应戴一次性手套操作)。 将其中一块玻板平置台上...
[目的] 掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法 [原理] DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3-OH末端上进行的。由于2，3-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。 本实验根据此原理，将待测DN...
3、质粒膜板制备：参照第一章所述的方法。 （二）超螺旋质粒DNA 的碱变性： 1、取4mg（约2pmol）超螺旋质粒DNA 至一eppendorf管中，加无离子水到终体积18ml。 2、加2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液，置于室温(25℃下）保温5分钟。 3、加2ml 2mol/L NaAc溶...