目的： 1、掌握用细胞破碎液裂解菌体细胞，并通过电泳的方法细胞中不同分子量质粒的方法； 2、从实验六的氨苄青霉素抗性转化子中筛选仅含一个拷贝目的基因的重组载体。 原理： 挑选8～10个白菌落接于平板过夜培养。利用破碎细胞缓冲液中的十二烷基硫酸纳（SDS...
材料、设备及试剂 一. 材料 E. coli DH5，BL21菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；T-vectorDNA: 购买或实验室自制，eppendorf管。 二. 设备 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。 三. 试剂 1.LB固体...
材料、设备及试剂 一、 材料 外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: T-vector(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5,或JM系列等具有-互补能力的菌株。 二、 设备 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂...
【原理】 引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5末端可以增加一些非互补碱基，因此可以在两引物的5末端设计单限制酶或双限制酶切位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计...
【原理】 经TaqDNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带有单个A。正是基于这一原理，pGEM-T质粒经EcoRV切成平端后，在开口端加上一个T制成T载体，一方面避免了自身环化，另一方面由于T-A互补，从而提高了T载体与PCR产物之间的连接效率。由于T-A克隆只需纯化PCR产物...
（二）目的克隆的鉴定 经过初步筛选获得的阳性克隆，下一步必须对带有目的序列的克隆做进一步筛选和鉴定。鉴定一般有几种常用方法：（1）分子杂交；（2）免疫学检测；（3）DNA测序；（4）蛋白质活性筛选；（5）基因互补实验。 1. 分子杂交 核酸分子杂交有多种...
（3）插入表达筛选法 与插入失活相反，插入表达法是外源目的基因插入特定载体后，能激活用于筛选操作的标记基因的表达，由此进行转化子的筛...
2. 定向克隆 使目的基因按一定的方向插入载体的克隆方案称为定向克...
二、重组DNA分子转入真核细胞 1. 根癌农杆菌Ti质粒介导法 农杆菌介导的Ti质粒载体转化法是目前研究最多、机制最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。迄今为止约8096的转基因植株都是利用农杆菌介导转化系统获得的。 农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴...
第一节 转化 基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。 一、重组DNA分子转入原核生物...