【实验试剂与器材】 （1）Oligo(dT)纤维素 （2）层析柱装置 （3）1上样缓冲液：20mM Tris.Cl (pH7.6)，0.5M NaCl，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.1%十二烷基肌氨酸钠(SLS) 配制方法: 用Tris.HCl、NaCl和EDTA母液，加入各成分确切含量后，15磅高压15分钟，待溶液冷...
【注意事项】 基因组DNA分子量大，所有操作必须轻柔，酚/氯仿对皮肤有腐蚀作用，应该戴手套操作。 二、RNA的制备 【实验目的】 1.理解生物细胞中RNA制备方法的原理。 2.熟悉组织细胞中RNA制备的基本操作。 （一）细胞总RNA的提取 1.异硫氰酸胍法 【实验原理】...
在体外将两个或多个来源相同或不相同的DNA片段连接成新的重组DNA分子，再转到特定宿主细胞中进行自主复制并表达。这是分子生物学中的基本技术。 DNA重组技术的基本程序包括： （1）获得外源DNA：外源DNA是进行DNA重组的目的DNA片段，一般采用 DNA聚合酶链式反...
二、目的基因和载体的连接 获得目的基因后必须将其放在一定的载体内才能在宿主细胞内扩增或表达。目的基因与载体的连接及其后续的转化过程习惯上称为克隆（cloning）。由于目前很多基因都是利用PCR技术获得，因此这里先介绍PCR产物的克隆策略，然后再介绍其他...
一、目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。目前用于获得目的基因的方法有几种，如限制性内切酶直接分离法、文库筛选法、体外扩增法和人工合成法等，其中限制性内切酶法...
一、实验目的 用T4DNA连接酶将载体pBR322 EcoR Ⅰ-CIP处理的DNA片段，与目的基因5.4KbEcoR Ⅰ片段连接起来，构建体外重组DNA分子，同时学习几种DNA连接的方法。 二、实验原理 重组的DNA分子是在T4DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲液系统中，将...
（二）Klenow片段酶 Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 。 酶催活性：⑴5 3 的聚合酶活性 ⑵35 的核酸外切酶活性 Klenow片段的主要用途（利用5 3 的聚合酶活性）： ⑴修补限制性酶消化DNA形成的3隐蔽...
与II型核酸内切酶有关的几个概念 粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。 平 末 端 ：Blunt end在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端...
2.M13噬菌体载体的构建 ⑴ 在IS区内插入 Lac Z基因 ⑵在标记基因区内组装MCS区段 所以能通过a互补在X-Gal/ IPTG平板上识别重组体。这类载体包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等 这类载体的突出优点在于其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。其最大的...
2、pUC质粒载体 1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的。 结构： （1）来自于pBR322的Ori （2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。但核苷酸序列发生了变化 （3） LacZ基因 编码半乳糖酶的肽链即氨基末端。 （4）MCS区段 是一段用于插入外源D...