四、连接产物的转化 1.感受态细胞的制备 ⑴ 保存于-70℃的DH5（或其他菌种）用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16 hr）。 ⑵ 挑取单菌落，接种于2.0ml LB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。 ⑶ 取0.5ml...

所谓亚克隆就是对已经获得的目的片段进行重新，其目的在于对目的进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚的基本过程包括：(1)目的片段和载体的制备； (2)目的片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛...

平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条 DNA链的3末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于...

第二节 材料、设备及试剂 一、 材料 外源DNA 片段: 自行制备的带限制性末端的DNA 溶液,浓度已知; 载体DNA : pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5,或JM系列等具有-互补能力的菌株。 二、 设备 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴...

第一节 概 述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆 较小的DNA 片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆 ,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到...

1 基因芯片技术分离目的基因 生物芯片是高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子的微列阵。列阵中每个分子的序列及位置都是已知的，并按预先设定好的顺序点阵。基因芯片是生物芯片的一种，其上固定的是核算类物质，主要用于DNA、RNA分析。分为DNA芯片和微点...

利用计算机来协助克隆 基因，称为电子基因克隆 （sillcon cloning），是与定位克隆 、定位候选克隆 策略并列的方法之一，即采用生物信息学的方法延伸EST序列，以获得基因部分乃至全长的cDNA序列。EST数据库的迅速扩张，已经并将继续导致识别与克隆 新基因策略...

DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA 连接...

2． 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。 3． 结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4．PCR的...

2. 连接产物的转化 ⑴ 取100l贮存于-70℃钙化菌，冰浴化开； ⑵ 加入适量连接产物（一般不超过10l，轻轻混匀，冰浴20min； ⑶ 于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min； ⑷ 加入LB液体培养基200l，于37℃缓摇孵育45min； ⑸ 将培养物适量涂于1.5%...