（一）gt11 cDNA文库铺平板 宿主细菌制备 1.用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种25ml LB培养基（Y1088用于噬菌斑杂交，Y1090用于免疫筛选），于37℃振荡培养过夜。 2.将过夜培养物以3000g离心5min。 3.分别用2ml -dil（10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol /L M...

[大量制备生产单链噬菌体DNA] 1.新鲜过夜培养的宿主菌XLI-Blue，以1：20稀释在LB培养液中，在37℃培养扩增2小时。 2.加1ml含单链cDNA的上清液。 3.再于37℃继续培养2小时。 4.然后将全部溶液转到500~1000mlLB中，生长5~6小时。 5.9500rpm离心60分钟，除去细菌...

[cDNA末端磷酸化] 1.70℃灭活反应后，稍微离心一下，置室温5分钟。 2.在反应混合物（10l）中加入： 1l10连接缓冲液 2l10mMATP 1l（10）DNA激酶 [限制性内切酶消化]以得到粘性末端 1.限制性内切酶消化DNA和载体。 2.在37℃保温1~5小时，然后冷却到室温，如果选...

[第一条链cDNA合成] 1.合成第一条cDNA链时，所有试剂应按下列顺序依次加入： 10第一条链合成缓冲液5.0l 10mMdNTPMix(1.4g/l)2.5l(终浓度1.25mM) Linkerprimer(1.4l，终浓度100g/l) DEPcH2O RNaseblockⅡ(1U/l)1.0 mRNA1~5g 混合，离心20秒钟，室温放置10分钟...

接头-衔接子与cDNA的连接 8.将下列试剂加入到已削成平末端的DNA中： 10T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 2l 800~1000 ng 的磷酸化接头或衔接子 2l T4噬菌体DNA连接酶（105 Weiss单位/ml） 1l 10 mmol/L ATP 2l 混匀后，在16℃温育8~12h。 9.从反应液中吸出0.5l贮...

10. Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的dNTP和 cDNA分开。 11. 加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的cDNA，将样品置于冰上至少15分钟，然后在微量离心机上以最...

分为六个阶段： 阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2：cDNA第二链的合成 阶段3：cDNA的甲基化 阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 阶段6：cDNA与噬菌体臂的连接 [阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链] 1.在置于冰上的无...

一、实验目的 掌握植物cDNA合成的原理和方法 二、实验原理 反转录酶主要用于体外cDNA的合成。目前最常用的反转录酶(reverse transcriptase) 有SuperscriptII、M-MLV和AMV等。它们具有依赖于RNA或DNA的DNA聚合酶活性和RNaseH酶活性，可以以RNA分子为模板，合成...

[实验原理] 总RNA，经寡聚(d丁)纤维素亲和层析柱分离出mRNA，以寡聚(d丁)为引物，经反转录合成双链cDNA。先用反转录酶合成第一条cDNA链；经碱降解作用除去RNA模板后用大肠杆菌DNA聚合酶，以第一条链cDNA的3末端结构为引物合成第二链，最后形成双链cDNA。 [仪...

2. 电泳分析 (1) 用50mM NaCl， 1mM EDTA制备1.4%的碱性琼脂糖电泳， 并置碱性电泳缓冲液中30分钟。 (2) 取样品液， 用TE调整体积， 使第一链和第二链产率测定液的体积相同，加入等体积的2样品缓冲液(20mmol/L NaOH， 20%甘油，0.025%溴粉兰）。 (3) 加样，电...