一、准备工作 1、实验器具与材料： （1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）EP管1。5ml、100ul （4）水浴箱 2、实验器具的处理与准备 塑料制品：（包括吸头、EP管等） 将塑料制品逐个浸泡于1DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃...
成功的RT PCR的要素 1、高质量RNA 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般不必使用oligo（dT）选择性分离poly（A）+RNA。不管起始...
一般的琼脂糖凝胶电泳，注意不要用甲醛变性电泳（又不是做northern，实在没有必要）。电泳槽注意一定不要用DEPC处理，一定要保证电泳体系中有少量的RNAase存在。分别在加样孔中加入1，2，3lRNA抽提溶液。在旁边加入DNA marker。1%琼脂糖凝胶，10V/cm的电压，...
第一部分 RNA 提取策略 1、RNA降解的原因内源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因为人体细胞自身就是几十分钟（20min？）mRNA被降解一轮，所以不管是组织还是细胞还是液体状样本在离开其中细胞的最佳生活状态后都应该尽快的被妥善的方法保存起来。外源性RN...
原位聚合酶链式反应（in situ PCR）和原位反转录聚合酶链式反应（in situ RT-PCR）操作规程 （一）、仪器设备 英国Thermo Hybaid原位PCR仪。 （二）、操作流程 1、原位PCR步骤 1）预处理： （1）切片常规脱蜡； （2）0.2mol/L HCl 处理10min； （3）5g/ml蛋白...
材料： （1）急性期病人血清、鼠肺、鼠血或分离的汉坦病毒 （2）引物： 引物 序列（ 5 ～ 3 ） 位置 片段（ bp ） 逆转录引物 TAGTAGTAGACTCC 1~14 LMS 通用外引物 AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG 1910~1939 M(+) GTACAICCTGTRCCIACCCC 2373~2354 M(-) 型特异...
可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞 说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了 如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了 第二次的引物设计要求可以低一点 以50l体系为例 引...
室温下充分混匀，离心10000g2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100l氯仿，混匀，离心10000g2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10l、预冷无水乙醇250l，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100l...
3． 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。 4． 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。 5． RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。 6． 一个杂交体系中...
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0.22m滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 6. 设置RNA操...