Q1．CT值出现过晚 1.扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。 2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。 3.PCR产物太长。一般采用80-150bp的产物长度。 Q2．无CT值（信号）出现 1.反...
下表列出了部分文献报道的TaqMan Probes技术所使用的酶和其它相关参数。 Target P1 P2 Probe Enzyme 退火温度 延伸温度 HCV 19 25 27 AmpliTaq DNA polymerase 60℃ 60℃ HIV 19 22 32 AmpliTaq Gold polymerase(Perkin-Elmer) 60℃ 60℃ Albumin 22 22 26 A...
一．实时定量PCR基本原理 1.PCR反应动力学 右图为PCR反应曲线（横坐标为循环数，纵坐标表征产物量），不同的曲线代表初始模板量不同的 PCR反应。PCR反应的动力学公式为： Cn=C0(1+E)n 其中C0和Cn分别为初始模板和n循环的拷贝数，n为循环数，E为扩增效率（0E1...
用于检测细胞基因转录水平的实时定量PCR 的操作流程 （Real Time Quantitative PCR Protocol For Detection of Gene Expression） 第一部分 原理 real time PCR 是普通PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质，使得DNA的数量与检测到的荧光强度成线性...
第三步：寻找一家信赖的公司合成引物和探针，一般引物合成大家比较熟悉，而且价格也比较便宜（特别是这两年便宜了许多），而探针则相对来说贵了许多，一般 Taqman探针合成在1000到5000元不等（不同的合成要求价钱不同）而这只是标记价钱，序列合成基本上和引...
自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信...
1、反应体系 25ulCocktail 20 ul: Primer FP 1 ul + Primer RP 1u + 2 * SYBR GREEN I MIX 12.5 + H2O 5.5 ul cDNA 5 ul 2、Primer 浓度，需要摸索，从200nM到700nm等，设置不同浓度。 3、每个引物浓度，从well 1到12设置4个样本，阳性cDNA 1和2，NTC以及H2O...
众所周知，PCR（聚合酶链反应）技术自从1985年问世以来，经过十几年的发展，已成为实验室的常规技术。它是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。相比于传统的临床诊断方法，核酸诊断是分子水平上的诊断技术，可以弥补传统临床诊断...
实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1．内标在传统定量中的作用 由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行...
第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。 随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5末端序列及从带有二级结构区域或带...