基因的PCR扩曾反应（聚合酶链式反应）

实验原理：

聚合酶链式反应（PCR，polymerase chain reaction）实质是体内DNA复制的体外模拟。当双链DNA变性为单链以后，DNA聚合酶以单链DNA为模版，并利用反应混合物中的四种dNTP，以与模板互补的寡聚核苷酸链为引物，合成新的DNA互补链。新合成的DNA链的起点，由加入在反应混合物中的一对寡聚核苷酸引物在模板DNA链两端的结合点决定，经过PCR的循环即模板DNA变性为单链、引物与模板退火（杂交）、DNA合成三步骤的反复重复，最后，两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数在理论上可扩增达2n，使特定的DNA区段得到迅速、大量的扩增。经过30~35个循环，可将2kb的DNA从1pg扩增到0.5-1μg，能够通过琼脂糖凝胶电泳检测出来。

转基因植物由于含有目的基因，当用针对目的基因来说为特异的一对寡聚核苷酸链作为引物，对其总DNA作PCR时，可以得到特异性产物（目的基因），而非转基因植物的总DNA不会扩增出特异性产物。

一、 材料

待扩增的基因样品

二、 设备

基因扩增仪(PCR仪)，台式离心机，电泳仪，紫外监测仪

三、 器皿

微量移液器，微量离心管（0.5ml），微量吸头（Tip头），电泳槽

四、 试剂

Taq酶，dNPT，10×Taq酶buffer，特异寡聚核苷酸引物（primer），模板DNA，无菌去离子水，无菌矿物质油，琼脂糖，溴酚兰指示剂。

五、 方法

1、在0.5ml无菌Eppendorf管中，分别以被检测植物的总DNA、阴性对照、阳性对照DNA为模板，进行PCR扩增反应，并设置两个空白对照：没有DNA和没有引物的。

向各管中依次加入下列试剂（总的反应体积为50μl）：

无菌去离子水 33~32μl

1xTaq缓冲液 5μl

dNTP（各2.5mmol/μl） 5μl

引物R（20pmol/μl） 2.5μl

引物F（20pmol/μl） 2.5μl

模板DNA 1~2μl（含质粒DNA0.01~0.1μg或含植物总DNA0.05~0.5μg）

将以上各试剂（Taq酶除外）混匀后于94℃变性10min，取出离心管，快速离心几秒钟，使冷凝于管盖上的液体回到管底部，再加入1μlTaqDNA聚合酶（约2~3U），混匀后吸取少量灭菌的矿物质油覆盖于页面上。使用待加热帽的PCR仪时不必家矿物油。

2、设置PCR的循环程序，以下循环参数可作为参考：

98℃预变性2min；94℃变性30~60s；53~57℃退火1min；72℃延伸1~2min，循环25~35次后，72℃延伸10min（以保证扩增出来的片段都是全长的），扩增反应完全后，取样品反应液5~50μl，用合适的琼脂糖凝胶电泳检测扩增的结果并照相。

提示：

1、防止污染：

由于PCR反应的高灵敏性，所以在操作中要严防环境DNA污染，全部器皿均要求灭菌，最好戴一次性手套进行操作，矿物油要分装，一次用一支。为防止交叉污染，最好所有PCR试剂都事先分装成小份备用。装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在离心机上作瞬时离心，这样可减少污染机会。一般最后加模板DNA，且加样时忌形成喷雾，所有非即用管都应盖严。只要有可能，就应设置阳性对照（即由少量适当的靶序列参与的PCR）和一个空白对照（不含模板DNA的PCR），以检测PCR反应系统是否正常。

2、反应系统组成

（1）引物在PCR中的浓度常是1μmol/L，这一浓度足以完成30个循环的扩增反应，更高浓度可能导致出现意外的非靶序列的的扩增。如果引物的浓度不足，则PCR的效率极低。

（2）Taq DNA聚合酶催化以典型的PCR反应所需酶量约为2U。酶量少，扩增效率低；酶过量，则可能导致非靶序列的扩增。

（3）dDNA系在饱和浓度（每种dDNA20μmol／L）下使用。

（4）靶序列：含有靶序列的DNA以单链或双链形式加入到PCR混合液中。闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA，因此用质粒作反应模板时最好先将其线状化。模板DNA中靶序列的浓度因情况而异，可按已知靶序列量递减（1ng，0.1ng，0.01ng等）的方式设置一组对照反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。

3、一般来说，模板的作用量越多，PCR的效率相对也高一些，但有一定的限制，特别是在模板DNA质量不太好，杂质含量比较多时，模板增多反而会影响PCR的结果。

4、若PCR产物呈降解片段首先减少模板DNA用量。

5、PCR产物非特异性条带较多应首先提高退火温度，其次减少引物的用量。有时可以用首次PCR的产物为模板进行再次PCR以得到专一的特异性条带。