反向PCR(reverse PCR)原理、程序和局限

反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.

　　反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状 DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。

　　该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

　　利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。

反向PCR原理
反向PCR程序

　　用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由 PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4kb。在许多情况下，首先 需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游 或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类 型决定的接点(例如，互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列，初试时 最好靠近识别上个碱基位位的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向 PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入 合适的酶切位点。
　　用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反向 PCR大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环 化前需用Klenow或噬菌体T4DNA聚合酶修理(钝化)。连接前，需用酚或热变性使内切 酶失活。
　　聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部 分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。

反向PCR的局限

反向PCR在研究转座因子、反转录病及其他 能与基因组DNA整合或易位的DNA序列中有许多重要应用。这些应用包括序列的易位、 转座和基因融合，其中之一是已知序列，例如癌基因或免疫系统的基因组成。在所有 这些情况中，如已知序列插入未知序列或与未知序列并列，反向PCR可用于测定未知 边侧序列。反向PCR的主要优点是简单快速，可以研究许多独立克隆。其某些应用适 合于临床诊断。
　　反向PCR的局限之一是由未知边侧序列性质引起的，需用几种酶试验以选择产生 大小合适的片段的内切酶。另一局限是许多常用内切酶也在不适当位点裂解载体序 列。但一旦确定合适的内切酶，反向PCR方法是直接了当和可靠的。
　大多数真核基因组含大量中度或高度重复序列，YAC或科斯粒中未知接点序列有时也 包括这些序列。通过反向PCR扩增得到的探针可与许多基因组序列杂交，但它们在用 于染色体的步查或跳查方面会受到限制，在这种情况下，需要进行亚克隆。