免疫PCR技术材料方法和注意事项

基存免疫球蛋白（如IgG、IgM）的Fc片段上有糖在，因而可用能与糖基结合的Biotin-hydrazide作生物素标记。

（1） 将纯化的抗体（IgM或IgG， 0.1~1.0ml）在标记缓冲液（0.1Mol/L NaAc，pH值5.5， 0.1Mol/L NaCl）中4℃透析过夜。

（2）吸取0.5ml至微量离心管中，加过碘酸钠溶液至终浓度为10mMol/L，置冰浴上于暗处孵育30min，使抗体分子上的糖基氧化。

（3）将氧化的抗体过PBS平衡的Sephadex G25 PD-10预装柱，使之与过碘酸钠分开。收集蛋白峰。

（4）向抗体管中加入Biotin-LC-hydrazide(Pierce)至终浓度5mMol/L，置混摇器上室温孵育1h。

（5）用含0.02%NaN3的PBS平衡Sephadex G25预装柱，将生物素标记的抗体分子过柱与游离的生物素分开。收集蛋白峰，保存-20℃。

2. 生物素标记DNA片段的制备

作为将与抗体偶联的报告DNA片段，应确保在待测抗原来源的机体DNA中无同源序列，如可选用大肠杆菌的序列作为报告DNA去检测人源的标本。 DNA片段大小为300~500bp，生物素标记可采用PCR方法，根据报告DNA的核苷酸序列合成一对引物，其中一个引物的5’端碱基上带有生物素标记。在0.5mlPCR管中按表将下列试剂混合。

表PCR系统组成

试 剂 添加量 终浓度
　　10×PCR 缓冲液 10.0ul 1×
　　2.5mMol/L 4dNTP混合物 8.0ul 0.2mMol/L
　　50uMol/L生物素标记的上游引物 1.0ul 0.5uMol/l
　　50uMol/L生物素标记的下游引物 1.0ul 0.5uMol/l
　　15mMol/L模板 DNA 1.0ul 1.0ug
　　Taq DNA聚合酶1.0ul 5U
　　加水至 100uL
　　混匀后上面覆盖液体石蜡。

95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min; 40个循环。最后72℃延伸10min。加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul 3Mol/L Kac，250uL无水乙醇，置-70℃ 30min。离心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。 将沉淀DNA干燥后溶于TE缓冲液中，保存在-20℃。

3. 制备抗体-亲和素-DNA复合物 子浓度的生物素标记的DNA片段，继续孵育30min，最后加入10倍分子浓度的生物素，将亲和素分子上的结合部位饱和。最后过凝胶过滤柱将复合物与未结合的单体分开，加入BSA达 1mg/ml，分装后冻存于-20℃。
4. 免疫PCR

将生物素标记的抗体与亲和素按等分子浓度混合于含有1mg/mlBSA的PBS中，室温孵育30min，再加入两倍分

（1） 按常规ELISA方法，用饱和缓冲液稀释抗原，加到96孔塑料板或0.5mlPCR管中，4℃过夜。

（2） 用PBS洗三次，然后每孔加200ul封闭液（PBS含10mg/mlBSA，1mg/ml鱼精DNA），室温孵育30min。

（3） 用TETBS（其配方：20mMol/L EDTA，0.02%NaN3）洗三次。

（4） 将抗体-亲和素-DNA复合物稀释于含有1mg/mlBSA和0.1mg/ml鱼精DNA的TETBS中，每孔加50ul，室温孵育1h。

（5） 用TETBS洗5次，然后将塑料板或管倒置在吸水纸上拍打以控干水分。

（6） 每管中加50ulPCR反应液，含有表成分：

表 PCR反应液

试 剂 添加量 终浓度
　　10×PCR缓冲液 5.0μl 1×
　　2.5mMol/L 4dNTP混合物 4.0μl 0.2mMol/L
　　50uMol/L生物素标记的上游引物 0.5μl 0.5μMol/l
　　50uMol/L生物素标记的下游引物 0.5μl 0.5μMol/l
　　15mMol/L MgCl2 5.0μl 1.5μg
　　Taq DNA聚合酶0.5μl 2.5U
　　加水至 50μL

混匀后上面覆盖液体石蜡。95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增35个循环：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min。最后72℃延伸10min。每管取5ul作琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后观察结果，如在PCR时加入了放射性核素标记，则可用X 光片显影。亦可在凝胶电泳后做Southern-blot，用特异性探针杂交，进一步提高其特异性和敏感性。　

(二)注意事项

本实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA偶联的方法，因每个链亲和素分子可与四个生物素分子结合，因此要优化反应条件，以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子，又能结合上DNA片段。

此外，还可用化学方法将DNA片段与抗体分子共价偶联，即将抗体分子和5’端氨基酸修饰的DNA片段分别用不同的双功能偶联剂激活，然后通过自发的反应偶联到一起，比如，用N-Succinimidyl-S-acetyl thioacetate(SATA)活化氨基修饰的DNA片段，用Sulfo-Succinimidyl 4-(maleimidomethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate(Sulfo-SMCC)修饰抗体分子，然后将二者在一小管中混合，通过加入盐酸胲（Hydroxylamine hydrochloride）使二者偶联在一起。

免疫PCR具有高敏感性。因此，抗体和标记DNA的任何非特异性结合均可导致严重的本底问题。因而在加入抗体和标记DNA后必须尽可能彻底地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记DNA被洗掉了，亦可在最后通过增加PCR的循环次数得到弥补。此外，应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也是非常重要的。可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封闭剂，用鱼精DNA做核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染，这也是所有敏感的检测系统存在的问题。即使每一步试验都做得非常认真，重复使用同样的引物和标记DNA均会产生假阳性信号。

免疫PCR的一个优点是标记DNA序列完全是人为选定。因此标记DNA及其引物可经常变换，以避免由于污染造成的假阳性信号。

免疫PCR可以检测到常规免疫学方法无法检测的样品。因此，应用免疫PCR可在微观水平（单细胞）检测抗原，定量PCR产物可以估计某一标本中的抗原数量，在临床诊断中可在疾病早期抗原量很低时检测到微量的抗原。