蛋白质组与蛋白质组学简介-2

3 甲基化干扰实验

用来检测蛋白质的结合位点。甲基化修饰的DNA探针可以干扰蛋白质的结合。结合位点上未被修饰的DNA片段才能与蛋白结合，然后将DNA从被修饰的碱基处切割，电泳分离，结合蛋白的DNA在结合位点上不能被修饰，不能切断，可确定结合位点的位置。

4 Dnase I 足纹分析

蛋白质精确结合位点的研究方法。Dnase I 可以切割DNA中磷酸二酯键，而结合蛋白质的DNA免于Dnase I水解，不能被切割。

方法：选择性末端标记DNA片段，加入蛋白质形成复合物，后加入Dnase I ，形成1个碱基的梯度，而蛋白质结合部位，留下空白。

5 随机PCR

随机PCR可以模拟体内DNA-蛋白质相互作用机制。动态地观察DNA-蛋白质的结合情况。

随机ＰＣＲ试验的步骤

１）合成寡核苷酸：随机序列区域

２）标记核酸成探针

３）进行多次凝胶滞后实验

４）确定特异性探针后，进行克隆和测序，统计随机序列区域各碱基出现的数量，

动态确定蛋白质结合部位。

6 核酸-蛋白质杂交

southwestern杂交。鉴定蛋白质与DNA特异性结合，确定结合蛋白质的分子量

7.蛋白质－核酸紫外交联法

ＤＮＡ－蛋白质复合物经紫外线照射后，导致交联。交联的部位在ＤＮＡ的嘧啶碱基和蛋白质的多种氨基酸的侧链基团。

紫外交联使ＤＮＡ上的标记转移到蛋白质上，进而可利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定其分子量。

七、蛋白质组及其质点的分离与分析

1 二维电泳（2-DE）

目前最有效的蛋白质分离技术。它包括等电聚焦凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者根据电荷的差异，后者根据分子量不同将各种蛋白质和成分分离。

维电泳的原理

１）等电聚焦电泳：

两性电解质含有脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成稳定的ＰＨ梯度，当蛋白质电泳到其等电点处，净电荷为０，停留在此位置，进而将蛋白质分离开。现建立一种新的 IEF，使用固相ＰＨ梯度等电聚焦（IPG-IEF），它的分辨率比传统IEF具有更高分辨率，分辨率可以达到0.001pH。

2）SDS-PAGE

SDS：十二烷基硫酸钠是一种去污剂，从而使蛋白质获得负电荷，因此屏蔽蛋白质，因此电泳迁移率仅与分子大小相关。

2-DE步骤：样品制备、蛋白质的溶解、变性、还原以及去除、蛋白质杂质，IPG胶制备、双向电泳、蛋白质的染色

蛋白质染色：

1）考马斯亮蓝染色：蛋白质常用的染色方法，灵敏度比银染低，但利于蛋白质的图谱分析。

2）银染色：是一种灵敏度高、分辨率好、应用广泛的方法。缺点是银染条带与蛋白质量不成比例，不便于蛋白质图谱分析。银染时常常造成蛋白质末端封闭，不能进行序列分析。

2.蛋白质芯片技术:

将蛋白质固定在硅物质表面,通过大分子之间的特异性识别和结合进行检测.

3.质谱分析技术

原理:将样品离子化,根据不同的质量和电荷差异确定分子量的技术。

应用:1）蛋白质序列分析：质谱形成的肽离子为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中肽健断裂，性成一系列碎片，进行序列分析；2） 蛋白质修饰分析

八、 蛋白质分子结构分析:

测定溶液中蛋白质结构:核磁共振、圆二色谱法、荧光光谱法等测定晶体蛋白质结构：X射线衍射分析法、小角中子衍射法。

九、蛋白质数据库

（一）蛋白质序列数据库

1.SWISS-PROT数据库：蛋白质序列、文献、分类等。

http://www.ebi.ac.uk/swissprot

2.PIR和PSD数据库：最大的数据库

htpp://pir.georgetown.edu

（二）蛋白质结构数据库

1.蛋白质数据仓库（PDB）：蛋白质分子的三维结构。（X光晶体衍射和核磁共振）

http://www.rcsb.org/pdb

2.蛋白质结构分类数据库（SCOP）：蛋白质之间的关系

http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/

3.PROSITE数据库：提供蛋白质位点和序列模式

http://www.expasy.ch/proside/

十、蛋白质组学研究：

1 用于疾病诊断的研究

2 发病机制的研究

3 致病菌耐药性研究