作者:中华医学网
发布时间:2017-10-15 21:16浏览:
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1. 分离胶的制备
(1)凝胶中丙烯酰胺的百分比浓度(X%)与蛋白质的分辨范围
(2)分离胶的配方:
30%丙烯酰胺储存液、4 ×分离胶缓冲液、蒸馏水、10%过硫酸铵、TEMED
灌制分离胶。
(3)分离胶的灌制:
(1)按说明书组装好凝胶模具,对于Bio-Rad 微型凝胶系统,在上紧夹具之前,必须确保两块凝胶玻璃板和底部的封胶橡胶条紧密接触,避免漏胶。
(2)将30%丙烯酰胺储存液与4x分离胶缓冲液以及蒸馏水在一个小烧杯中混合。
(3)加入过硫酸铵和TEMED后,轻轻搅拌混匀(凝胶会很快聚合,操作要迅速)。
(4)将凝胶溶液用吸管沿长玻板壁缓慢加入制胶模具中,避免产生气泡。凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm(距梳子齿约 0.5cm),接着在分离胶溶液上轻轻覆盖约1cm高的蒸馏水以封胶。约30min后,若在分离胶与水层之间可见一个清晰的界面,表明凝胶已聚合。
3. 浓缩胶的配方 5%的浓缩胶4ml, 用于Mini-Protein Ⅲ 型电泳槽
4. 浓缩胶的灌制
(1)向一侧倾斜制胶模具,吸掉覆盖在分离胶上的水;将30%丙烯酰胺储存液与4x浓缩胶缓冲液及蒸馏水在小烧杯内混合,加入过硫酸铵和TEMED,轻轻搅拌使其混匀。
(2)将浓缩胶溶液用吸管加至分离胶上面,直至前玻璃板的上缘。
(3)迅速将点样梳插入凝胶内,直至梳齿的底部与前玻璃板的上缘平齐。待凝胶聚合 (约30min) 后,小心拔出点样梳。
5. 预电泳 将1X电泳缓冲液加入内外电泳槽,使凝胶的上下端均能浸泡在电泳缓冲液内;接通电源,上槽为负极,下槽为正极,80V预电泳3~5min。
6. 样品制备/上样/电泳 将20?滋l蛋白质样品与20?滋l 2×上样缓冲液,在Eppendorf管中混合,100℃加热3~5min;离心 5~10s,用微量注射器或移液器将样品(弃沉淀)缓慢滴入凝胶梳孔中;继续低电压(80V)电泳至样品进入分离胶,再将电压调至150V,保持恒压电泳,直至染料迁移至凝胶的底部(对于两块6cm×8cm×0.75mm的凝胶,约需50min),电泳结束。
小心撬开玻璃板,凝胶便贴在其中一块板上;切去浓缩胶和某一胶角(作标记)。
7. 染色与脱色 将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中,置摇床上缓慢震荡30min以上(染色时间需根据凝胶厚度适当调整)。取出凝胶在水中漂洗数次,再加入考马斯亮蓝脱色液、震荡。凝胶脱色至大致看清条带约需1h,完全脱色则需更换脱色液2~3次,震荡达24h以上。
凝胶脱色后可通过扫描、摄录等方法进行蛋白质定量检测。
【注意事项】
1. 凝胶不聚合的可能原因
(1)试剂质量差,应使用电泳级别的试剂。
(2)过硫酸铵和TEMED的量不够或失活,可增加剂量或重配新鲜的储存液。
(3)凝胶聚合时温度太低,应以室温为宜。
2. 上样时,样品不能沉到加样孔底部,可能是上样缓冲液中甘油含量不足;或是加样孔底部留有聚合的丙烯酰胺。
3. 经过煮沸的样品虽然可以在-20℃保存数周,但若反复冻融会导致蛋白质的降解。从-20℃取出的样本,上样前应先升至室温,确保SDS沉淀溶解。
4. 注意避免电泳条带弯曲畸变:①“微笑” 现象(如图25-1所示),可能是因为凝胶中间部分温度过高,降低电压便可得到改善.②“皱眉”现象,常常是因为凝胶底部有气泡或聚合不均匀。③“拖尾”、“纹理”现象,则多为样品溶解不佳,增加蛋白样品的溶解度并离心除去不溶性颗粒即可克服。④“晕轮”效应(holo effect)多为加样过量所致。
5. 非特异性的染色主要是由于未溶解的染料的沉积而成,应将染料溶液过滤后再用。
6. 如果电泳后将对蛋白质进行定量检测,须特别注意:1)已知和未知样品必须使用相同的溶剂系统、相同的浓度、相同的加样量,并在同一块凝胶上电泳和染色。