表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

[实验原理]

细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。

[主要试剂]

1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37OC溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。

2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。

3、1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。

4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。

5、10´电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。

6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。

7、2´SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，b-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。

8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。

9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。

操作步骤]

1、聚丙烯酰胺凝胶的配制

<!--[if !supportLists]--> （1） <!--[endif]--> 分离胶(10%)的配制：

<!--[if !supportLists]--> （2） <!--[endif]-->

 

ddH2O	4.0ml
30%储备胶	3.3ml
1.5M Tris-HCl	2.5ml
10% SDS	0.1ml
10% AP	0.1ml
TEMED	10μl

上述混合液混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平整。（凝胶完全聚合需30-60min）。

（2）浓缩胶（4%）的配制：

 

 

ddH2O	1.4 ml
30%储备胶	0.33 ml
1M Tris-HCl	0.25 ml
10% SDS	0.02ml
10% AP	0.02ml
TEMED	2μl

 

将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。

2、样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。

3、上样: 取20μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。

4、电泳:在电泳槽中加入1´电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压80V，分离胶电压180V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。

5、染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4-6hr。

6、脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。

7、凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。

[注意事项]

1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。

2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。

3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护