RAPD分子标记的实验原理及操作流程

RAPD标记
RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR，单一引物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点 DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。

一、实验材料
　　不同来源的DNA(30-50ng/ul)。

二、实验设备
　　PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置，凝胶成像仪。

三、试剂
　　1、RAPD引物：购买成品或根据赛百盛（SBS）公司设计的RAPD引物序列（http://www.sbsbio.com/pro11_1.asp）合成。
　　2、Taq酶
　　3、10xPCR 缓冲液
4、MgCl2：25mmol/L。
　　5、dNTP：2.5mmol/L。

四、操作步骤：
　　1. 在15ul反应体系中，加入
　　　　模板DNA 1ul (30-50ng)
　　　　RAPD引物 1ul (约5pmol)
　　　　10xPCR Buffer 1.5ul
　　　　MgCl2 1ul
　　　　dNTP 1ul
　　　　Taq酶 0.5单位（U）
　　　　加ddH2O 至 15ul
　　混匀稍离心, 加一滴（约20 ul）矿物油。
　　2. 在PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 36℃ 1分钟， 72℃ 1分钟，共40轮循环。
　　3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。
4. 在15ul PCR产物中加2ul上样缓冲液(6x)于1.6% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ。
5. 电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。
6. 用凝胶成像仪观察、拍照。
操作流程简图：

注：样品可以采用新鲜样品，硅胶干燥样品，标本等
DNA提取可采用CTAB或SDS法
DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法