基因的PCR扩增实验原理、实验材料和操作步骤

实验原理
单链DNA在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用DNA聚合酶按5’→3’方向复制出互补DNA。这时单链DNA称为模板DNA，寡聚核苷酸片段称为引物（Primer），合成的互补DNA称为产物DNA。双链DNA分子经高温变性后成为两条单链DNA，它们都可作为单链模板DNA，在相应的引物引导下，用DNA聚合酶复制出产物DNA。PCR反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列DNA分子两端各设计一条引物，其中在DNA5’端的引物（Pl）对应于上链DNA单链的序列，3’端的引物（P2）对应于下链DNA单链的序列，Pl和P2按5’→3’方向相向配置。在含有引物、DNA合成底物dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物）的缓冲液中，通过高温变性，使双链DNA变成单链DNA模板，降低温度复性，使引物与模板DNA配对，利用DNA聚合酶便可合成产物DNA。引物和dNTPs过量，则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增，所以这一反应称为聚合酶链式扩增反应。理论上如果引物及dNTP的量能够满足，则这一过程可无限重复，使模板DNA无限扩增。PCR反应使几个DNA模板分子通过数小时扩增后增加到百万倍以上，因此能用微量样品获取目的基因，同时也完成了基因在体外的克隆，成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。
常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，反应循环数为25～35，变性温度为94℃，复性温度为37℃～55℃，合成延伸温度为72℃，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受 95℃左右的高温而不失活），DNA扩增倍数为106～109。
引物的设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵守以下几条原则：①引物长度：15~25个核苷酸；②CG含量为40%~60%；③Tm值高于 55℃[Tm=4(C+G)+2(A+T)计算]；④引物与模板非特异性配对位点的碱基配对率小于70%；⑤两条引物间配对碱基数小于5个；⑥引物自身配对（特别是在引物的3’端）形成的茎环结构，茎的碱基对数不大于3。由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。

实验材料和试剂
（一）试剂
1．4×dNTP： lmmol/L dATP
lmmol/L dCTP
lmmol/L dGTP
lmmol/L dTTP
2．Taq酶：5U/ml
3．模板DNA：0.1mg/ml
4．引物：Pl： 5'-TTCCATATGCCTACTTCAAGTTCT-3'
P2：5'-ACCTAAGCTTGCTTCAAGTTAGTGT-3'
引物溶液浓度：50nmoI/L
（二）器皿
0.5ml薄壁Eppendorf管
（三）仪器
PCR自动扩增仪 离心机
微量注射器 微量移液器
电泳仪 水平电泳槽
透射紫外观察仪

实验步骤
（一）准备PCR反应溶液
1．取薄壁 0.5mlEppendorf管一只，用微量注射器按以下顺序分别加入各试剂。
10×缓冲液10ml
4×dNTP10ml
引物Pl1ml
引物P21ml
模板DNA1ml
Taq酶1ml
加无菌双蒸馏水至100ml
2．用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底。
3．加石蜡油50ml封住溶液表面。
（二）PCR扩增反应
将加好样品的Eppendorf管插在PCR自动扩增仪样品板上，95℃10分钟，使模板充分变性。然后按以下步骤在PCR自动扩增仪中进行反应，25～35个循环。
93℃30秒
55℃45 秒
72℃45秒
反应完毕，将样品取出置于冰浴中待用。

（三）结果检测
本实验PCR扩增的产物DNA片段长度为609bp，适合于1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
【提示】
（一）引物设计
由于PCR反应在实用中，模板DNA往往来源于组织和细胞，所以样品的DNA背景十分复杂（如一个人的细胞含有30亿对碱基的DNA）。设计引物时不能通过检索这些DNA的背景资料来得到特异性的引物，也就是说设计的引物不能完全排除与背景DNA还存在有大部份配对或完全配对的位点，尽量使设计的引物符合设计的一般原则，将可通过控制PCR反应条件来减少非特异性配对位点对反应的干扰。
（二）非特异扩增产物的出现
当扩增的DNA产物不止一种时，通常与以下几种情况有关：①背景DNA有与引物同源性高的其它位点。可通过在两个引物的内侧序列上再使用另外一对或二条引物对扩增的产物DNA再做PCP扩增；②退火温度太低。引物与模板的配对是一个动态过程，分子的热运动使引物与模板结合与解离而达到最佳配对位点上。退火温度太低，造成引物与模板的非特异性位点部分配对而不解离下来，这种不正确的配对，进入PCR反应过程就可扩增出非特异的产物DNA。提高反应的退火温度（有时此Tm值高出几度）将可改善结果；③过量的酶、引物和dNTP可使PCR反应造成混乱，强行扩增出非特异产物DNA，适当降低这些试剂的量有助于问题的解决。
（三）PCR反应扩增不出DNA条带
在实验中偶而会出现这类情况，一般有以下几种原因：①引物的3’端与5’端书写错误，造成引物合成的错误。此时应重新合成引物；②引物溶液反复冻融或污染了DNA酶类，造成引物降解。换一份引物可解决该类间题；③模板DNA制备时模板己降解。这时应尽量找一些指示指标来检测模板质量；④Taq酶有失活或有杂酶污染。重新换一份酶；⑤缓冲液条件不当。各类PCR反应要求的条件并不完全一致，其中Mg2+离子的浓度对Taq的活性影响尤为明显，Mg2+浓度直接影响到DNA扩增的特异性和扩增DNA的产率，在反应体系中，由于DNA模板、引物、四种dNTP的磷酸基团，以及引物、模板原液中的EDTA等螯合剂都要结合Mg2+,因此合适的Mg2+浓度至关重要。一般的情况下，过量的Mg2+会导致酶催化非特异性产物的扩增，而Mg2+浓度过低，又会影响 Taq酶的活性，使产物DNA量降低。为了选择到最佳的反应条件，在实验前，可设置在一定浓度的模板DNA、引物、dNTP和循环参数下，用不同浓度（如 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、……5.0mmol/L）Mg2+进行预实验。在确定大概浓度后，可在该浓度上以0.2mmol/L增减。 10×缓冲液中用100mmol/LTris-HCl是一种双极性离子缓冲液，以维持合适的pH的缓冲能力，10×缓冲液中的100mmol /LKCl是有利于引物的退火，但是过高的KCl将抑制酶的活性。缓冲液中的明胶、TritonX-l00是为了稳定酶不变性失活，有的反应中加入 100mg/ml的小牛血清白蛋白或0.05%Tween20，以及5mmol/LDTT，都是酶的保护剂。50%甘油是为使酶保存于-20℃时，不因结冰而失活。这些酶的保护剂如果浓度过高，特别是质量欠佳时，往往都抑制酶在反应中的活性，在使用时应特别注意。在反应体系中如果加入10%的 DMSO（二甲亚砜）可以减少二级结构的形成，增加反应的特异性，但它对酶的活性也有少许抑制作用。
（四）反应体系加样顺序
反应体系一般为50～100微升体积，体系中加样顺序为dH2O补充体积，10×缓冲液（体积1/10），4种dNTP（各 20～200mmol/L），两条引物（各0.1～0.5mmol/L），模板DNA要根据其分子量而定，一般在102～105拷贝数；Taq酶常要稀释为2.5单位/100ml。为了防止高温反应时液体的挥发，常加入石蜡油封闭体系。
（五）脱氧核苷三磷酸浓度
脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）在反应中的浓度也非常重要，常用的浓度一般为20～200mmoI/L，而且四种dNTP的终浓度相等。高浓度会抑制TaqDNA聚合酶的活性，引起聚合酶催化错配，而且由于反应中dNTP结合Mg2+的量较大，所以四种dNTP的量相应为Mg2+的浓度提供参考。
（六）温度和循环参数
PCR扩增循环中的变性、退火、延伸的过程是反应体系在合适的条件下，通过不同的温度变化来实现的。在PCR中控制温度是关系到实验成败的重要环节。PCR的变性是实验进行的基础，如果加热的温度不能使靶基因模板和PCR产物的双链完全变性解离，则会造成PCR实验的失败。常用的变性温度是90℃～94℃，为了提高变性效果而又不影响酶的活性，可在加酶前于97℃变性5分钟左右，加酶后的循环变性中以93℃～94℃变性30秒；退火的温度依赖于引物的长度、浓度及碱基组成如CG的含量，一般为 55℃30秒钟，引物的退火温度可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)公式进行计算；PCR的延伸温度在70℃～75℃之间，常用72℃，延伸 1分钟，延伸的时间要根据扩增DNA的长度而定；PCR循环的次数为20～35次，循环次数取决于模板DNA的浓度。循环的次数越多，反应非特异产物也越多，因此循环次数不宜过多。