PCR扩增DNA（PCR Amplify DNA）实验原理、材料和操作步骤

【实验原理】
聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种体外 DNA扩增技术，1985年由Mullis等人创立。该技术能在几小时的实验操作中，将人为选定的一段DNA扩增几百万倍，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点，目前已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段，另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。
PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA 为模板，从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链。这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA，假设PCR的效率为 100%,反复n周期后，理论上就能扩增2n倍。PCR反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。
常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95℃，复性温度为37℃～55℃，延伸合成温度为72℃，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），反应循环数为30。

【实验材料】
1.实验器材
PCR扩增仪，台式高速离心机，移液器，经高压灭菌后的Eppendorf 管，电泳仪。
2.实验试剂
（1）模板DNA（0.1µg/µl）：用牙签挑取单菌落悬浮到50µl的裂解液中（裂解液 1%TritonX-100，20mmol/lTris-HClPH8.2,2mmol/lEDTA）,95℃温浴10分钟,10000rpm离心5分钟,取2µl上清液用于总体积50µl的PCR反应。
（2）TaqDNA聚合酶（5U/µl），10×扩增缓冲液，dNTP（1mmol/L）：购买
（3）引物（100pmol/L）：设计并合成与目的DNA两侧互补的引物内。

【实验操作】
1．准备PCR反应溶液
（1）按以下次序，将下列成分在0.5ml灭菌Eppendorf管内混合：
10×扩增缓冲液10µl
4×dNTPs(包括四种dNTP)8µl
引物 11µl
引物21µl
模板DNA1µl(10ng)
TaqDNA聚合酶1µl(2.5U)
加水至终体积100µl
（2）用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底。
（3）加石蜡油50µl封住溶液表面。

2．PCR扩增反应
将加好样品的Eppendorf管置于PCR扩增仪内，95℃5分钟，使模板DNA 完全变性。然后按95℃变性1分钟，55℃退火45秒，72℃延伸1分钟，重复循环30次，循环结束后72℃延伸8分钟。反应完毕，将样品取出置-4℃待用。

【实验结果】
取出样品，进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳，溴化乙锭(EB)染色，观察DNA条带。
【讨论】
1．PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有必要进一步优化反应条件，包括改变退火温度和时间，调整Mg2+浓度等。
2．PCR反应特异性强，引物浓度、TaqDNA聚合酶和dNTP的量不宜过多。
3．引物设计要合理。一般引物长度为18 个~30个核苷酸；引物间的G+C含量应为40%～60%，而且避免引物内部产生二级结构；引物3ˊ端不应该互补，避免在PCR反应过程中产生引物二聚体；避免引物3ˊ端出现3个连续的G或C；理想的情况下，成对引物的G、C含量应相似以便以相近的退火温度与互补的模板链相结合，此外，引物5ˊ端序列对于后续操作也是十分有用的，例如，对PCR产物进行克隆时，可以考虑在引物5ˊ端引入限制性酶切位点。