实时定量PCR技术综述（原理、荧光标记、TaqMan Probes和Hybridiz

一．实时定量PCR基本原理
1.PCR反应动力学
右图为PCR反应曲线（横坐标为循环数，纵坐标表征产物量），不同的曲线代表初始模板量不同的 PCR反应。PCR反应的动力学公式为：
Cn=C0(1+E)n
其中C0和Cn分别为初始模板和n循环的拷贝数，n为循环数，E为扩增效率（0≤E≤1），理想状态下（即每个循环中所有模板均与引物结合并等到扩增），E为1。
由上图可知，只有在线性区段E值才为定值，这样才能通过检测Cn定量C0，由于终点检测不能保证在线性区段，所以重复性不好，实时检测（每个循环检测一次）技术解决了这个问题。
2.定量PCR原理

定量PCR是将待测标本与一系列浓度（C0）已知的标准品在同一条件下共同扩增，并进行实时检测，根据标准品的检测值及已知的C0值作出标准曲线，如右图（横作标为的C0对数值），再根据待测标本的检测值在标准曲线上查到待测标本的C0值。
3.信号产生
目前定量PCR技术信号产生都是基于 FRET (fluorescence resonance energy transfer)的原理，即在一定波长的光激发下，一个荧光基团A发光，并且被邻近的另一个荧光基团B吸收，使荧光基团B发光。如检测荧光基团A，应在FRET消除后；如检测B，则应在FRET发生时检测。
根据信号产生方式的不同可将定量PCR技术分为三类：TaqMan Probes技术；Hybridization Probes技术；Molecular Beacons技术。
TaqMan Probes技术（右图A）是Perkin
Elmer公司1995年研制，利用热稳定DNA聚合酶5’→3’外切酶活性，将TaqMan 探针 5’端荧光基团切去，使之与3’端荧光基团分离、荧光淬灭消失，在特定波长下检测5’端荧光基团即可表征PCR产物的量。
Hybridization Probes技术（右图B）是Roche公司建立的，PCR反应退火过程中，两个探针与模板杂交（相邻一个碱基），发生FRET，这时检测第二个荧光基团即可表征PCR产物的量。Hybridization Probes技术要求热稳定DNA 聚合酶不具备5’→3’外切酶活性，而是在引物延伸过程中被取代，使探针可在下一循环再与模板杂交，如探针被降解，可导致定量不准。

Molecular Beacons技术（上图C）利用茎环结构的探针，当形成茎环结构时，发生荧光淬灭，退火过程中，探针与模板杂交，荧光淬灭消失，在特定波长下检测5’端荧光基团即可表征PCR产物的量。

二.荧光标记
1.TaqMan Probes
TaqMan探针通常在5’端以荧光基团FAM标记，靠近 3’端以荧光基团TAMRA标记，3’端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。下表列出了两种荧光基团的吸收及发射波长。

 

 

	FAM	TAMRA
吸收波长	492	547
发射波长	518	573

2.Hybridization Probes
Hybridization探针技术中，上游donor Probe 3’端以荧光基团Fluorescein标记；下游acceptor Probe 5’端以Roche的LC-Red 640标记（当用双荧光基团时还可同时使用LC-Red 705），3’端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。也有文献报道acceptor Probe 5’端以Cy5标记，下表列出了各种荧光基团的吸收及发射波长。

 

 

	Fluorescein	LC-Red 640	LC-Red 705	Cy5
吸收波长	494	625	685	643
发射波长	519	640	705	667

3.荧光标记基团与 PCR仪的激发与检测波长
由于荧光标记基团的选择还受到定量 PCR仪所提供的激发和检测波长的制约，所以这里介绍一下临床应用中主流机型所提供的检测波长，见下表。

 

 

	GeneAmp 5700 SDS	ABI Prism7700(适用于科研)	LightCycler
检测波长	530nm	500-660nm	530nm;640nm;705nm

三.TaqMan Probes技术要点

 

TaqMan Probes技术要求所用的热稳定DNA聚合酶不但要具有5’→3’外切酶活性,而且要求所获得的扩增曲线符合PCR反应动力学。
Matthew J.Longley等（1990）研究了热稳定DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性,认为：（１）其5’→3’外切酶活性和DNA聚合酶活性位于同一肽段；（２）5’→3’外切酶活性依赖于双链DNA（如右图）；（３）5’→3’外切酶活性具有热稳定性，之所以70℃较50℃活性低（如右图）是由于高温破坏了探针与模板间的双链结构。
K-A.Kreuzer等（2000）研究了15种热稳定DNA聚合酶（商品）的5’→3’外切酶活性，其中7种声称具有5’→3’外切酶活性，右图是这７种酶的定量PCR反应（TaqMan）曲线,其中部分酶没有5’→3’外切酶活性、部分酶具有较弱的5’→3’ 外切酶活性、只有一种酶的扩增曲线（A）符合PCR反应动力学。