噬菌体转导实验原理、材料和实验步骤

以局限性转导为例来说明转导的基本原理，进一步验证 DNA是遗传物质，并初步掌握转导实验的基本方法。

二、实验原理与意义

转导是以噬菌体为媒介将一个细胞的遗传物质转移给另一个细胞的过程。随着分子遗传学的发展，转导已成为基因精细结构分析的常用方法。

转导实验中常用的是λ噬菌体，它能整合在大肠杆菌染色体 DNA 上的半乳糖基因（ gal ）和生物素基因（ bio ） 之间，因此，它能转导半乳糖基因（ gal ）又能转导生物素基因（ bio ）。本实验选用大肠杆菌 E.coli K 12 ( λ ) gal + 为供体菌（即λ噬菌体的 DNA 已整合在大肠杆菌的 DNA 上，我们称该大肠杆菌为溶源性大肠杆菌， gal + 表示此大肠杆菌带有半乳糖基因）。由于在此供体菌中λ噬菌体与半乳糖基因（ gal + ）紧密连锁，因此，当此供体菌受紫外线照射后产生裂解反应，噬菌体被诱发释放，以一定的比例形成带有半乳糖基因的转导噬菌体。当这种转导噬菌体与受体菌 E.coli K 12 (s) gal ˉ （此细菌不能利用半乳糖， gal ˉ 表示此细菌不含半乳糖基因） 混合接触时，带有供体菌 gal + 基因的转导噬菌体能以一定的频率整合到受体菌上，从而使不能利用半乳糖的 gal ˉ 受体菌转变成了能利用半乳糖的 gal + 细菌。 整个过程可用图表示：

k12(λ) gal+（供体菌）

↓UV

λgal+

↓

供体菌含溶源噬菌体 噬菌体被诱发释放（1） 噬菌体被诱发释放（2）
噬菌体被诱发释放（3） 噬菌体侵入受体菌 噬体菌整合到受体菌上

受体菌获得利用半乳糖的能力

利用噬菌体的细菌转导过程

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K12 S gal¯ 受体菌) →K12 S gal¯ /λgal+ （转导子）(

供体菌含溶源噬菌体 噬菌体被诱发释放（1） 噬菌体被诱发释放（2）

噬菌体被诱发释放（ 3） 噬菌体侵入受体菌 噬体菌整合到受体菌上

受体菌获得利用半乳糖的能力

利用噬菌体的细菌转导过程

三、实验材料

1 、 菌种 ：供体菌： E.coli K12( λ )gal +

受体菌： E.coli K12 Sgal -

1、 培养基 ：肉汤液体培养基；肉汤固体培养基； 2E 肉汤液体培养基；半固体素琼脂培养基；半乳糖 EMB 培养基；磷酸缓冲液

2、 用具 ：培养皿（ 9cm ）、三角烧瓶（ 50ml ）、试管、离心管、吸管（ 5 、 1 、 0.1 ml ）、涂棒、水浴锅、离心机、紫外照射箱、温箱

四、实验步骤

1、噬菌体的诱导和裂解液的制备

（ 1 ） 供菌体的活化与培养：取一环供体菌，接种于盛有 5 ml 肉汤液体培养基的三角瓶中， 37 ℃培养 16 h 后，吸 0.5 ml 菌液，接种于盛有 4.5 ml 肉汤液体培养基的三角瓶中，继续培养 4-6 h 。

（ 2 ） 制备悬浮液：将三角瓶中的菌液倒入离心管，以 3500 rpm ，离心 10 min 。离心后，除去上清液，加 4 ml 磷酸缓冲液，打匀沉淀，再以 3500 rpm ，离心 10 min ，这样反复洗三次，制备成悬浮液。

（ 3 ） 诱导裂解：取悬浮液 3 ml 于培养皿中，经 UV 处理（ 15W ，距离 40 cm ），诱导 10-20 s 。

（ 4 ） 避光培养： UV 处理后，加入 3 ml 2E 肉汤液体培养基，为防止光复活， 37 ℃避光培养 2-3 h 。

（ 5 ） 制备裂解液：吸取培养物于离心管中，以 3500 rpm ，离心 10 min ，吸取上清液，再加入 0.2 ml 氯仿（ 4-5 滴），激烈振荡半分钟，静置 5 min ，小心把上清液用无菌吸管转移到另一试管，这就是噬菌体 ( λ )gal + 的裂解液。

2 、 噬菌体效价测定

（ 1 ） 受菌体的活化与培养：挑取受体菌一环，接种于盛有 5 ml 肉汤液体培养基的离心管中， 37 ℃培养 16 h 。然后，从受体菌培养液中吸取 0.5 ml ，放入盛有 4.5 ml 肉汤液体培养基的三角瓶中，继续培养 4-6 h ，作指示菌用；剩余的菌液用于点滴法转导试验，随即放入冰箱保存，供后面涂布转导试验用。

（ 2 ） 双层培养测效价：①取已经熔化并于 45 ℃保温的半固体琼脂试管 4 支，每支加上述的指示菌液 0.5 ml 。②取噬菌体裂解液 0.5 ml ，放入盛有 4.5 ml 肉汤液体培养基的试管中，依次稀释到 10-7 。③从 10-6 、 10-7 的试管中分别吸取 0.5 ml 裂解液，加到有指示菌的半固体琼脂中（每个稀释度 2 支），摇匀，分别倒入事先准备好的肉汤固体培养基培养皿中，摇匀，凝固后， 37 ℃培养过夜，观察出现噬菌斑数，并计算噬菌体裂解液的效价。

计算方法：效价（单位 / 毫升） = 两皿平均斑数 * 稀释倍数 * 取样量折算数。

图 4-3-2 培养皿皿底画线

3、 转导方法

（ 1 ） 点滴法：①取倒好 EMB 培养基的培养皿 2 只，在皿底用记号笔按图 4-3-2 中的样子画好。②取一满环受体菌，涂出一条菌带，共涂二条， 37 ℃培养 1.5 h 。③取出培养皿，在二个圆圈和四个方格处，各加一环噬菌体裂解液，二个圆圈作为对照，四个方格作为转导处理，培养 2 天，观察结果。

（ 2 ） 涂布法：①取倒好的 EMB 培养皿六只，先做好标记，其中两只加 0.1 ml 噬菌体裂解液，用于对照；两只加 0.1 ml 受体菌，也用于对照，两只加噬菌体裂解液和受体菌液各 0.05 ml 。②用玻璃涂棒将各皿上的菌液（或噬菌体裂解液）涂开，相同的 2 只培养皿用同一根玻璃涂棒， 37 ℃培养 2 天，观察结果。

五、实验结果

观察记录下表数据，并分析实验结果。

表 1 噬菌体效价测定

表 2 细菌转导结果

注：菌落生长者：“ + ”表示；菌落不生长者：“ - ”表示