胶体金标记蛋白A技术（Protein A-gold technique, PAg法）-1

PAg复合物制备方法简便，作为第二抗体，无种属特异性，可以免去不同种属动物要制备不同的特异性免疫球蛋白。PAg 复合物与包埋剂和细胞成分都极少发生非特异性的交互作用，蛋白A和金粒间非共价的结合特性既不影响蛋白A的活性，又能保持高度的稳定性，PAg复合物分子最小易于穿透组织。PAg复合物的原液在4℃可保存达一年之久。电镜水平的PAg染色法 PAg法在电镜技术的应用原则是二步标记法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要区别于一般胶体金免疫染色在：①须1%卵白蛋白－PBs （pH7.4）或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris缓冲液（pH7.4）来封闭非特异性的结合部位，而不是采用羊或其它的动物的正常抗血清，因为PAg复合物能够与正常血清组中的Ig结合，从而给出假阳性结果；②在应用第一抗血清孵育和PBS冲洗后作第二抗血清即PAg复合物孵育前的准备时，应用的PBS或TBS的pH应变更为pH8.2.其它可参照本节中包埋后染色法进行。

一、液体配制：

1、胶体金稀释液配方：

（PH＝8、2）的0.02mo1／L Tris TBS缓冲液，加入试剂级卵清白蛋白至1％。｛免疫电镜按1：20-50稀释，淡红色为适宜稀释液，胶体金稀释后应于当天使用，未用完的应该丢弃。（免疫胶体金说明书）｝

2、清洗液：

0、5mol／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液：Tris，60.57g，1mol／L Hcl约420m1，调pH值至7.4，最后加双蒸水至1000m1，此为储备液。

0、05mo1／L Tris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；0.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液100m1；加双蒸水至 1000m1，调pH值至7.4.

0、02mo1／LTris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；o.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液40m1，加双蒸水至 l000m1，调pH值至8.2.

3、H2O2的配制:3% H2O2

4、8％过碘酸钠水溶液

5、封闭液：

前封闭液：1%卵白蛋白—0.05mo1／LTris缓冲液（pH7.4）；

后封闭液以及胶体金稀释液：1%卵白蛋白—0.02mo1／LTris缓冲液（pH8.2），后封闭为胶体金结合作准备。

二、具体操作:

（一）包埋：

常规电镜制样，样品只需要戊二醛固定，不需要锇酸后固定。丙酮梯度脱水时70％的丙酮中没有添加染色剂。样品于37度烘箱中固化。

（二）切片：

超薄切片厚50～70nm左右，载于300网孔的镍网上。
（三）抗原修复：

1、置1%H2O2内10min至1h（视树脂的硬度和切片的厚度而定），以去锇酸和增进树脂穿透性，有利抗体进入。如切片很薄或于低温包埋时，此步可省略。操作时，滴入1%H2O2液1滴于蜡板上，将网的载片面轻浮于液滴上。对中枢神经系统切片，有主张以1%过碘酸钾（KIO4）代替H2O2的。

（同时用8％过碘酸钠水溶液代替双氧水，室温5～25分钟以及丙酮对环氧树脂进行溶解。看三者那个效果最好）

2、双蒸水洗3次，每次10min，第1，2次浮于液滴上清洗，第3次以盛双蒸水的注射器沿镍网面冲洗，水流应有适当压力，但不宜过高强，用滤纸在网缘将水吸干。(0.05mo1／L TBS pH7.4洗5min×3次?)

三、封闭以及免疫反应：

1、载有超薄片的镍网或金网浮于1%卵白蛋白－TBS（7.4）液滴上，室温约1h，阻断非特异性吸附，吸去多余血清，不洗。

2、载网直接移至第一抗血清液滴上(抗体稀释度较常规免疫组化低l倍)，在室温孵育2h或4℃18～24h.

3、0、05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。0.02mo1／L TBS PH8.2，洗5min×3次。1％卵清白蛋白 0.02mo1／L TBS（8.2） 37℃孵育l h，再次阻断非特异性吸附，吸去多余液体，不洗。

4、将PAg原液稀释10～20倍（1：30～1：100，淡红色为适宜稀释液），载网浮于该液滴上，室温孵育10min至1h（37℃孵育 2h？）。

5、0、02mo1／L TBS pH8.2，洗5min×3次。0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。最后切片浸于 0.05m01／L TBS pH7.4缓冲液中，送电镜室处理（含2%戊二醛及3%多聚甲醛的TBS液固定30分钟？）。

四、电子染色以及电镜观察

1、5%醋酸铀（双蒸水配制）染5min，然后用双蒸水洗。

2、枸橼酸铀（或醋酸铅）染色5min，双蒸水洗净。

3、H－600透射电镜观察。

五、免疫胶体金试验成功的要求

抗体高度特异性和亲和力以及被检组织内抗原含量高；标本的前处理和染色也至关重要。

取消锇酸后固定，聚合温度不宜高于45度，可以选用37度12小时，45度48小时作为聚合温度。试验全过程应保持网面的湿润。缓冲液要清洁，最好用新鲜配制的或经微孔滤纸过滤后使用。

染色前所用器皿必须清洁干净且专用，并用双蒸水冲洗三遍，染色程序中的洗涤必须充分，以减少背景染色。尤其双重免疫标记的切片染色时，第一次金标二抗孵育后必须充分洗涤，以不影响第二次金标二抗的反应结果。摘自:贾云香，卓夏阳，顾云娣。双重胶体金标记的免疫电镜技术。江西医学院学报，2003,43(4):22-24

将免疫组织化学技术与电子显微镜技术相结合，则可以利用电子显微镜高分辨率的优点，在超显微结构水平定位细脑内的特异性抗原。为疾病的病因、发病机理、组织来源等方面的探索研究，为提高疾病的认识与诊断提供可靠的手段。

六、附录

1、试剂配制：

(1)4％多聚甲醛一0.01％戊二醛溶液：多聚甲醛4g，0.2m01／L二甲砷酸钠缓冲液(内含0.2mol／L蔗糖，0.4mmo1／L CaCl2)50 m1，20％戊二醛40ul，双蒸水加至100m1.