操作简便，不需要特殊仪器（酶联检测仪）。
【试剂及配制】
(1) 稀释液：为1%A的0.01mol/L pH7.4的。
(2) 封闭液：为2% A的0.01mol/L pH7.4的。
(3) 洗涤液：为0.5% Tween 20的0.01mol/L pH7.4的。
(4) 底物溶液：见附录。
【操作方法】
(1) 取适当大小NC膜（0.3mm、0.45mm和0.65mm均可），用铅笔画好5mm´5mm的加样方格，并作好相应标记
(2) 将NC膜浸入0.01mol/L pH7.4的中15~30min，取出用滤纸吸干；
(3) 将标准抗原和待检样本点加于NC膜，室温干燥；若估计待检样本抗原量较少，可重复点加。有条件者可用dot-blot点膜器点样；
(4) 将NC膜浸入封闭液中振摇封闭30min。此步骤至关重要，不可省略；
(5) 将NC膜浸入洗涤液中振荡洗涤3次，每次30min，取出用滤纸吸干；
(6) 将NC膜浸入酶标抗体溶液中，振摇反应30min；
(7) 重复步骤（5）；
(8) 将NC膜浸入底物溶液中，振摇显色15~20min；
(9) 用流水冲洗数分钟，放入蒸馏水中终止反应；
(10) 根据显色反应有无或颜色深浅，进行定性或半定量。
【注意事项】
(1) 包被用的抗原或抗体的蛋白浓度一般为1.0~10mg/ml，但最好是预先经过方阵法滴定选择其最佳工作浓度。
(2) 在包被后，用1~5% A或5%~20% 进行封闭至关重要，不可省略。因为用抗原或抗体包被后，固相载体表面往往尚残留少量未饱和的吸附位点，在随后反应中，会引起非特异性吸附，导致本底偏高。
(3) 已包被好的酶标板在经过洗涤后，加入0.01mol/L pH7.2的Tris-HCl缓冲液（含0.2%的NaN3）或10%硫酸铵溶液(用Tris-HCl缓冲液配制)，在4~6℃或室温下可保存3个月。
(4) 加底物前甩干的酶标板在空气中暴露的时间越长，吸光度越低。因此切忌在操作中将大批反应板洗涤后一次甩干，任其在空气中干燥。
(5) 聚乙二醇（PEG）可增强抗原抗体反应，促进可溶性免疫复合物的沉淀。在待测血清和酶结合物的稀释液中加入40g/L PEG6000可显著缩短反应时间。
(6) 在行双抗体夹心法时，不能只用一种mAb，而应选择针对不同抗原表位的两造mAb。